鉴定。基于线粒体细胞色素B(cytb)基因测序结果,提取单倍型序列,并利用最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)构建系统发育树,以此判定每个个体的物种类型。共对35个种群的503个样品进行了测序,得到了1 140 bp长度的cytb基因全序列,从中检测到150个单倍型。其中有20个单倍型属于甘肃鼢鼠,有4个单倍型属于斯氏鼢鼠构成单系群,其余126个单倍型属于高原鼢鼠。在35个种群中,有28个全部为高原鼢鼠,有5个种群全部为甘肃鼢鼠,另有2个种群分别由高原鼢鼠+甘肃鼢鼠(DT2)、高原鼢鼠+斯氏鼢鼠(ZN3)混合而成。结果表明,青海湖周边地区和黄河贵德段上游附近地区可以作为塞隆骨药材的正宗来源地,而利用cytb基因可以准确鉴定鼢鼠物种,从而精确判定塞隆骨正宗药材资源的地理分布。
[关键词]塞隆骨;鼢鼠;分子鉴定;资源分布
[收稿日期]2014-07-12
[基金项目]国家自然科学基金青年基金项目(31101628)
[通信作者]*林恭华,博士,主要从事动物学研究,Tel:15909717366,E-mail:lingonghua@nwipb.cas.cn
[作者简介]赵芳,博士研究生,主要从事动物学研究,Tel:18397102818, E-mail: zf_lgh@163.comMolecular authentication of Sailonggu and its resource
distribution in Qinghai-Tibet Plateau
ZHAO Fang, DENG Xiao-gong, ZHANG Tong-zuo, SU Jian-ping, LIN Gong-hua*
(Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota, Northwest Institute of Plateau Biology,
Chinese Academy of Sciences, Xining 810008, China)
[Abstract]To provide accurate information on geographic distribution of crude drug Sailonggu in the plateau, we identified zokor species (Eospalax spp.) in Qinghai-Tibet Plateau using molecular methods. Based on the mitochondrial cytochrome B (cytb) gene sequences, we then extracted haplotypes from these sequences and reconstructed phylogenetic trees for the haplotypes using both maximum likelihood (ML) and Bayesian inference (BI) methods. Based on the trees, the species of each sample were determined. Five hundred and three samples from 35 populations were sequenced and their whole cytb sequences (1 140 bp) were obtained. From these sequences 150 haplotypes were detected, in which, 126 were Eospalax baileyi, 20 were E. cansus, and 4 were E. smithi of the 35 populations, 28 were E. baileyi type, 5 were E. cansus type, and the remaining 2 were mixed of E. baileyi + E. cansus (DT2) and E. baileyi + E. smithi (ZN3). The results showed that, the regions around the Qinghai lake and near the upper stream of Yellow River started at Guide could be viewed as the producing area of authentic Sailonggu, and also, the cytb gene is a powerful molecular marker to determine the species of zokors as well as for the authentication of geographic distribution of Sailonggu.
[Key words]Sailonggu; zokor; molecular authentication; resource distribution
doi:10.4268/cjcmm20150306
塞隆骨是鼹形鼠科Spalacidae鼢鼠亚科Myospalacinae高原鼢鼠Eospalax baileyi的干燥全骨架<sup>[1]</sup>,是国家一类动物新药材。塞隆骨性微温、味辛咸,入肝肾经,主要功能为祛风除湿散寒、舒筋活络、强筋健骨及增强机体抵抗力,其药理学作用与传统名贵中药材虎骨类似<sup>[2-4]</sup>,是目前较理想的虎骨代用品。但是药酒厂在收购塞隆骨时,发现商品中有其他动物骨骼混淆的现象,而现有的鉴别方法准确性、实用性差。尤其是当与鼢鼠属其他物种相混淆时,由于这类动物对地下生活方式的趋同性适应,种间区分难度较大,对专业水平和经验的要求极高<sup>[5-6]</sup>。
随着分子生物学的发展,以DNA分子为标记鉴定动植物药材,正在发挥越来越重要的作用<sup>[7]</sup>。曹晖等<sup>[8]</sup>对高原鼢鼠18S rRNA序列进行扩增测序,结果显示,此分子标记可有效避免高原鼢鼠与小家鼠Mus musculus和褐家鼠Rattus norvegicus混淆。Zhou等<sup>[9]</sup>进一步利用线粒体12S rRNA 和cytochrome b(cytb)基因对鼢鼠属多个物种进行比较,结果表明,这2个基因标记可以有效鉴别塞隆骨(高原鼢鼠),而避免与其近缘物种甘肃鼢鼠E. cansus、罗氏鼢鼠E. rothschildi、秦岭鼢鼠E. rufescens、中华鼢鼠E. fontanieri等相混淆。其中,基于cytb基因构建的系统树支持率更高,其鉴定可靠性优于12S rRNA基因。
青藏高原是高原鼢鼠的特有分布区,之前的研究已经大致划定这一物种的分布范围<sup>[5]</sup>。值得一提的是,这种划分精度不高,在实际采集过程中容易产生混淆。例如,资料中提到青海省大通县属于高原鼢鼠分布区<sup>[5]</sup>,然而作者之前的研究显示,大通县小寺村采集的样品属于甘肃鼢鼠 [10]。研究同时显示,在湟水河流域的许多地区,都属于甘肃鼢鼠的分布范围。这些区域往往是捕鼠人员的居住地,许多捕捉和收购鼢鼠的活动在此进行。这就不可避免会产生不同鼢鼠材料的混淆,严重影响塞隆骨药材的道地性。笔者所在的研究组长期从事鼢鼠进化生态学研究,收集了青藏高原及周边地区大量的鼢鼠样品,对每一个采集地都进行了GPS定位。本研究利用这些鼢鼠样品,以cytb基因为遗传标记,对青藏高原地区的鼢鼠物种进行分子鉴定,为塞隆骨药材资源的地理分布提供准确的基础资料。
1材料
于2008—2012年用地箭捕捉鼢鼠,解剖后取大腿肌肉样品,用95%乙醇固定。记录采集地经纬度、海拔等信息。从35个采样点中共采集503份鼢鼠个体,涉及青海、甘肃、四川3省,具体采样信息及地理分布见表1。试剂包括动物组织DNA提取试剂盒(上海生工),Taq酶及PCR缓冲液(含Mg2+)(全式金),超纯水(自制)等。
2方法
2.1DNA提取、PCR扩增与测序取肌肉0.1 g左右,置于灭菌玻璃板上切碎,按照试剂盒说明书步骤提取基因组总DNA。Cytb基因的PCR扩增在Tgradient Thermocycler(Biometra)上进行,参数设置为:95 ℃条件下预变性3 min;95 ℃变性45 s,54 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.5 min,34 次循环;最后72 ℃续延伸7 min。反应体系为50 μL,内含200 mmol·L<sup>-1</sup> dNTP,每条引物0.2 mmol·L<sup>-1</sup>,1 U Taq酶及1 μL DNA 样本。正向引物L14724 (5′-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3′),反向引物H15917(5′-CGGAATTCCATTTTTGGTTTACAAG-3′)。扩增产物直接送上海生工进行测序,测序仪型号为ABI 3730 DNA Analysis System (Applied Biosystems,USA)。
2.2数据处理测序数据经Chromas 软件输出后,用Clustal X软件<sup>[11]</sup>的默认参数设置进行同源排序,并实施人工校对,最终得到可用序列以供进一步分析 。以DnaSP v5软件<sup>[12]</sup>统计序列变异位点信息,并输出单倍型和遗传多样性信息。
系统发生关系用最大似然法(maximum likelihood,ML) 和贝叶斯法(Bayesian inference,BI),分别用Phyml 3.1软件<sup>[13]</sup>和MrBayes 3.2.2软件<sup>[14]</sup>进行。在构建系统树之前,先用jModeltest软件<sup>[15]</sup>对所有单倍型序列进行模型测试,以Akaike information criterion(AIC)指数为指标,获得最适模型及相应的统计学参数。对ML法的分枝置信度进行100次Bootstrap自举检验;而对于BI法则设置2百万代(generations),保证其分裂频率标准偏差(standard deviation of split frequencies)小于0.01。构建系统树时,以平颅鼢鼠属的东北鼢鼠Myospalax psilurus作为外类群。同时,作者从GenBank下载已进行物种鉴定的凸颅鼢鼠序列<sup>[6]</sup>参与建树,用以判定本研究所测序列的物种属性。值得一提的是,这些已知序列中有部分两两之间完全相同,本研究仅随机保留其中1条。
3结果与讨论
对503个样品进行测序,得到1 140 bp长度的cytb基因全序列。共检测到311个变异位点,总体表1采样点、样本量及单倍型分布信息
Table 1Sampling sites, sample size, and haplotype distribution of zokors
地点简称经度纬度海拔/m样本量单倍型物种青海省班玛县多贡麻乡BM100°33′49.932″33°7′28.308″3 70514H1-H4Eb青海省称多县珍秦乡CD197°14′7.404″33°21′12.816″4 39013H5Eb青海省称多县歇武镇CD297°28′21.792″33°12′5.508″4 45014H6-H9Eb青海省称多县清水河镇CD396°56′37.392″33°46′10.704″4 55014H10Eb青海省大通县向化乡DT1101°47′20.688″37°9′7.308″2 98819H11-H23Eb青海省大通县黄家寨镇DT2101°43′3.972″36°50′29.148″2 3937H24-H26Eb+Ec青海省刚察县泉吉乡GC99°42′41.400″37°10′9.408″3 23514H27-H29Eb青海省贵德县尕让乡GD101°33′14.112″36°17′57.732″3 11911H30-H33Eb青海省共和县石乃亥乡GH99°44′5.928″37°2′1.752″3 20914H27Eb青海省贵南县过马营镇GN1101°4′8.868″35°46′32.088″3 25517H34-H39Eb青海省贵南县塔秀乡GN2100°27′42.588″35°34′38.568″3 30619H40-H44Eb青海省贵南县过马营镇GN3101°18′4.392″35°46′2.820″3 30212H36,H45-H47Eb青海省化隆县巴燕镇HL102°17′49.668″36°11′18.528″3 18514H48-H54Eb青海省河南县优干宁镇HN101°33′35.172″34°46′29.568″3 55214H55-H58Eb青海省湟源县大华乡HY101°4′41.412″36°39′16.560″3 04316H30,H59-H66Eb青海省互助县松多乡HZ1102°11′47.328″36°42′14.148″2 88010C27-C29Ec青海省互助县巴扎乡HZ2102°15′21.600″37°2′7.260″2 85715H67-H72Eb青海省久治县智青松多镇JZ1101°29′29.580″33°15′35.568″3 74117H73-H76Eb青海省久治县索呼日麻乡JZ2100°49′19.632″33°36′17.892″3 84714H77-H80Eb青海省乐都县下北山林场LD102°38′15.288″36°34′54.588″3 00011C30-C33Ec青海省民和县满坪镇MH1102°43′40.188″36°2′54.492″2 67011C34-C38Ec青海省民和县川口镇MH2102°49′16.248″36°15′30.240″2 31313H81-H84Ec青海省门源县东川镇MY101°49′31.620″37°19′24.528″2 71515H85-H86Eb青海省平安县寺台乡PA101°58′2.064″36°22′27.480″2 75011C39-C40Ec青海省祁连县八宝镇QL1100°11′35.340″38°6′14.688″3 21314H87-H90Eb青海省祁连县默勒镇QL2100°31′31.872″37°39′34.488″3 56616H27,H91-H95Eb四川省若尔盖县阿西乡REG2102°53′24.000″33°54′53.496″3 45014H96-H100Eb四川省若尔盖县唐克乡REG3102°31′59.916″33°24′36.900″3 49015H101-H102Eb四川省若尔盖县红星乡REG4102°43′16.608″34°6′11.088″3 24012H103-H109Eb青海省天峻县关角乡TJ98°52′15.492″37°10′46.704″3 84014H110-H114Eb青海省兴海县河卡镇XH99°55′7.320″35°51′10.728″3 56614H115-H116Eb青海省泽库县巴滩牧场ZK100°57′42.192″35°14′15.540″3 42825H38,H117-H124Eb甘肃省卓尼县啊子滩乡ZN1103°14′49.740″34°44′58.632″3 16023H125Eb甘肃省卓尼县完冒乡ZN2103°3′8.352″34°22′2.532″3 27012H125,H126-H131Eb甘肃省卓尼县申藏乡ZN3103°33′6.984″34°44′21.444″3 02015H125,H132-H136Eb+Es注:Eb.高原鼢鼠;Ec.甘肃鼢鼠;Es.斯氏鼢鼠。
赵芳等:青藏高原地区塞隆骨资源的分子鉴定和地理分布单倍型多样性(Hd±SD)为0.986±0.001,核苷酸多样性(Pi±SD)为0.062 38±0.001 23。从503个序列中共检测到150个单倍型,其中有5个单倍型在2~3个种群之间共享(H27,H30,H36,H38,H125)。各种群的单倍型组成在表1中列出,其中H1~H136对应GenBank号KM103774~KM103909,C27~C40对应GenBank号GQ244389~ GQ244402。
系统发育分析显示,ML,BI 这2种方法得到系统树的结构非常相似。结果表明,有20个单倍型(C27~C40,H024,H026,H081~H084)与现有甘肃鼢鼠形成单系群,有4个单倍型(H132~H134,H136)与斯氏鼢鼠构成单系群,其余126个单倍型(84%)与已知高原鼢鼠序列形成单系群,见图1。基于系统树和单倍型分布特征可以判定,HZ1,LD,MH1,MH2,PA种群中所有个体都是甘肃鼢鼠,DT2种群中同时具有甘肃鼢鼠和高原鼢鼠个体,ZN3种群中同时具有高原鼢鼠和斯氏鼢鼠个体,其他28个种群中所有个体都为高原鼢鼠(表1)。
A. 最大似然树;B. 贝叶斯树。
图1基于单倍型构建的系统发育树
Fig.1Phylogenetic trees based on zokor cytb haplotypes
本研究显示,青藏高原地区绝大多数种群都由高原鼢鼠组成,同时还有部分地区为甘肃鼢鼠、高原鼢鼠+甘肃鼢鼠、高原鼢鼠+斯氏鼢鼠种群。从分布区域上看,湟水河流域是甘肃鼢鼠的主要分布区,与多个高原鼢鼠分布区域接壤,最容易导致混淆。同时,县域并非判定鼢鼠物种的良好指标,如大通县和互助县分别都有高原鼢鼠和甘肃鼢鼠2个物种分布,而卓尼县则有高原鼢鼠和斯氏鼢鼠2个物种分布。从海拔上看,3 100 m以上区域只有高原鼢鼠分布,可以作为相对准确的判断标准,而3 100 m以下地区则3种鼢鼠都可能分布,不能作为判定依据。
之前的研究表明,鼢鼠属的物种进化过程具有异域发生的特点,称多地区(CD1~CD3)是迄今为止发现的高原鼢鼠最古老类群,之后向北向东扩散、分化<sup>[16]</sup>。而甘肃鼢鼠的古老类群则在陕西北部地区,之后向西扩展<sup>[10]</sup>,最后在青藏高原和黄土高原交汇的湟水河谷与高原鼢鼠汇合。斯氏鼢鼠的模式产地在甘肃省临潭县<sup>[6]</sup>,作者推测,本研究的ZN3种群也是斯氏鼢鼠向高原扩散并与高原鼢鼠汇合的地点。总体来看,青海湖地区和黄河贵德段上游地区可以保证都是高原鼢鼠。本研究表明,利用cytb鉴定鼢鼠种类完全可行,为保证塞隆骨药材的正宗性,建议利用此标记进行分子鉴定。
[参考文献]
[1]谢宗万,余友芩. 全国中草药名鉴[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1996.
[2]张宝琛. 塞隆骨代虎骨具有重要开发前景[J]. 中国中医药信息杂志, 1996, 3(7) : 381.
[3]潘明, 石珏, 罗霞, 等. 塞隆骨提取物对成骨样细胞增殖及凋亡作用的研究[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(23): 1991.
[4]赵晓辉, 岳会兰, 梅丽娟, 等. 塞隆骨提取物对牛 Ⅱ 型胶原诱导的小鼠关节炎的治疗作用及机制研究[J]. 中国药理学通报, 2008, 24(3): 395.
[5]樊乃昌, 施银柱. 中国鼢鼠 (Eospalax) 亚属分类研究[J]. 兽类学报, 1982, 2(2): 183.
[6]何娅, 周材权, 刘国库, 等. 斯氏鼢鼠物种地位有效性的探讨[J]. 动物分类学报, 2012, 37(1): 36.
[7]陈士林, 郭宝林, 张贵君, 等. 中药鉴定学新技术新方法研究进展[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(8): 1043.
[8]曹晖, 张绍来, 周开亚. 塞隆骨原动物高原鼢鼠核基因18SrRNA 序列测定与分析[J]. 中国中药杂志, 2001, 26(2): 90.
[9]Zhou C, Zhou K, Zhang S. Molecular authentication of the animal crude drug Sailonggu (bone of Myospalax baileyi) [J]. Biol Pharm Bull, 2004, 27(11): 1850.
[10]林恭华. 地下啮齿类——甘肃鼢鼠挖掘器官形态适应与种群遗传学分析[D]. 北京:中国科学院,2010.
[11]Thompson J D, Higgins D G, Gibson T J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice [J]. Nucleic Acids Res, 1994, 22(22): 4673.
[12]Rozas J, Sánchez-Del Barrio J C, Messeguer X, et al. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods [J]. Bioinformatics, 2003, 19(18): 2496.
[13]Guindon S, Dufayard J F, Lefort V, et al. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0 [J]. Syst Biol, 2010, 59(3): 307.
[14]Ronquist F, Huelsenbeck J P. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models [J]. Bioinformatics, 2003, 19(12): 1572.
[15]Darriba D, Taboada G L, Doallo R,et al. jModelTest 2: more models, new heuristics and parallel computing [J]. Nat Methods, 2012, 9(8):772.
[16]Tang L Z, Wang L Y, Cai Z Y, et al. Allopatric divergence and phylogeographic structure of the plateau zokor (Eospalax baileyi), a fossorial rodent endemic to the Qinghai-Tibetan Plateau [J]. J Biogeogr, 2010, 37(4): 657.
[责任编辑吕冬梅]