摘要:纳米科学与技术应用的核心发展方向之一,是其在生命科学以及人类健康关怀事业中的研究与发展。目前,纳米功能材料与器件除了在生物大分子,如DNA、RNA、蛋白分子结构与功能检测方面的应用与开发研究之外,特别重要的是,在医学领域中形成了众多的可运用技术,主要包括:纳米材料与技术在纳米药物体系方面的应用、纳米材料标记与单分子检测技术、纳米材料与器件在医学临床诊断与重大疾病治疗中的应用、纳米材料应用与康复器械与人工器官等等。在对生物医药学纳米技术主要的应用研究进行概要的基础上,本文对东南大学纳米材料与技术在生物医药学领域中的主要研发工作侧重进行了一些介绍,并对今后的相应发展进行概略的讨论。
纳米科技的发展必须有三大基础支撑,这就是纳米材料学、纳米加工制造学与纳米结构表征测量学。由于纳米科技的基本思想、方法等可导入各个学科领域,于是便发展出众多的纳米科技新兴领域,如纳米体系物理、纳米体系化学、纳米机械学、纳米摩擦学、纳米电子学、纳米生物学、纳米医学等等。显然,纳米体系的物理与化学等与前述三大支撑都构成纳米科技发展的重要基础。同时,纳米科技应用在各个方面表现出的诱人前景是纳米科技发展的巨大推动力。
继扫描隧道显微镜(STM)发明并获得1986年物理学诺贝尔奖之后,1990年在美国的Baltimore市召开了第一届纳米技术国际学术会议(Nano'1),成为纳米科技发展起步的一个重要标志。同年创刊了两个国际学术杂志:《纳米技术》与《纳米生物学》,表明在纳米科技发展的初始阶段,借助扫描力显微术(SFM)对生物分子,特别是DNA的研究以及其他纳米生物结构的研究给予了极大的重视。到1999年,美国的Robert A. Freitas Jr.出版了其三卷本的《纳米医学》(第一卷),表明纳米科技的发展已促使人们开始多方面考虑并且探索了纳米科技在医学临床诊治、药物学等方面的应用。将纳米生物学的发展结合纳米医学的出现,在名称方面,有人称之为纳米生物医学(Nano-Biomedicine),也有的称作生物医学纳米技术(Biomedical Nanotechnology)。总之,这表明了纳米科技应用于生物医学诸多方面的重要进展。
纳米科技在生物医学方面的研究应用大致可包括这样几个方面:纳米观测技术在生物大分子结构与性质方面的研究;纳米器件在生物医学检测中的应用;纳米药物体系;纳米材料与技术在临床诊治中的应用,包括在康复医学中的重要应用。以下仅对纳米科技在生物医学有关方面的新近研究发展作一个概略的介绍。
一、纳米观测技术在纳米生物结构与性质研究中的应用
1982年IBM苏黎世研究实验室报道的STM使人类的视力首次在大气、室温甚至在溶液条件下延伸到纳米尺度。随后发展起来的原子力显微术(AFM)、电化学显微术(ECM)、磁力显微术(MFM)、电容力显微术(CFM)、电场力显微术(EFM)、以及扫描近场显微术(SNOM)等形成为纳米观测技术中强有力的工具。特别是,这些显微术不仅可进行微结构或形貌的观察测量,而且基于不同的成像原理可同时研究有关结构的性质。
1990年的IBM的Eigler等人最早报道了成功地利用STM操纵原子拼写字母的结果,表明人类不仅可以观察、测量这些纳米结构,而且还可以根据人的意志来加工制造最小的纳米结构。这些观测以及操纵原子的技术在最初的发展时期都被用于纳米生物学的研究,如DNA、RNA、某些蛋白分子、病毒等超细结构和生物学性质的观测。近来,随着SNOM、光镊、电场镊、分子梳等技术的不断进展,对单分子,特别是生物单分子的操纵和检测研究也发展很快,其实际医学应用前景非常美好。
对生物纳米结构的研究主要在于对生物大分子进行观测,特别集中在蛋白质和核酸分子的结构(几何尺度处于几十纳米至几纳米的范围)与功能之间的关系。Lee等人采用SFM,在观察微观结构的同时,直接测量了DNA互补链之间的相互作用力。此外,2000年Oesterhelt等人报告了采用原子力显微镜结合单分子力谱技术对噬盐菌的紫膜碎片进行成像和操纵。单个细菌视紫红质分子首次被固定并随后从膜中被提取出来,同时观察到遗留的空位。对不同的螺旋结构,锚定力介于100至200 pN之间。被取出的螺旋体呈现展开结构。力谱测量显示出螺旋体展开途径的各自特点:螺旋体G和F,与E和D一样,总是成对展开,而B和C有时相继展开。开环实验显示这种特性的原因,是因为螺旋体B的稳定性取决于相邻的螺旋体。
核糖体是合成蛋白质肽链的场所,在生物学领域中一直是重要的研究对象。Xiaowei Zhuang等人采用荧光显微镜研究了单个四膜虫噬热性核糖酶分子的折叠过程。采用荧光显微镜他们研究了单个四膜虫噬热性核糖体分子的折叠和催化性质。发现在溶液中染料标记和固定于表面的核糖酶在功能方面与没有修饰的自由核糖酶没有区别。在单分子时间轨迹上可直接观察到由核糖体核中的对接和非对接的可逆局部折叠步骤,使得可以确定速率常数和表征转变状态。在全部的折叠过程中,观察到中间折叠态和多折叠途径。相对以往观察到的折叠途径,发现一个新的折叠速率常数为1s-1的折叠途径。这些结果证明单分子荧光是考察RNA折叠的强有力的工具。
Weiss报告了一种新型的双光束荧光法,可用于测量生物大分子间的距离、相对取向以及距离和取向的变化等。目前他们可以分辨相距为10nm的两个荧光发光体,并可能进一步减小分辨距离。这项技术可以用于对细胞膜内的蛋白质同时进行荧光成像以及重新定位等目的,有望在分子水平上研究动态的生化反应,如蛋白与DNA的相互作用等。Betzig等人运用局域电场发射与分子电偶极子取向分析,已经观察到单个荧光分子相距约150nm的两个分子光谱。利用SNOM、脉冲激光激发以及时间分辨的光子技术,发现单个染料分子的荧光寿命与探针-分子相对位置的关系。
美国Princeton大学的等离子体物理实验室建成了波长为18.2nm的X射线激光器,并制成X射线激光接触显微镜,可用于观察活的细胞,如已观察到马蹄蟹免疫活细胞中一种从未知晓的精细特征。这种设备与反转相衬光学显微镜结合起来,能够用于对癌细胞进行内部动态代谢过程研究。利用纳米观测工具对生物大分子内以及分子间作用力的测量与分析,以及生物纳米结构(如细胞器),尤其是生物分子的动态过程,结合其相关的功能特性的研究成为当前该方面工作的主要热点。
利用纳米观测工具对生物大分子内以及分子间作用力的测量与分析,以及生物纳米结构(如细胞器),尤其是生物分子的动态过程,结合其相关的功能特性的研究成为当前该方面工作的主要热点。
二、纳米材料与技术在临床诊治与康复医学研究中的应用
因为某些纳米材料的一些特殊的性质,在诊断试剂、核酸分子分离纯化,乃至某些具体的疾病治疗方法中具有重要的应用前景。
采用超微金颗粒制成金溶胶,接上抗原或抗体就能进行免疫学的间接凝集试验,可用于快速诊断。如将金溶胶妊娠试剂加入孕妇尿中,未妊娠呈无色,妊娠则呈显著红色,仅用0.5克金即可制备1万毫升的金溶胶,可测1万人次,其判断结果清晰可靠。采用纳米金微粒标记在免疫学实验中已是较成熟的技术,目前又发展了在同一个样品上可将纳米金标记与采用银或金增强的其它标记方法,如酶标记技术结合起来,并且可容易地区分两类不同类型的信号。例如,采用纳米金标记结合银增强以标记感兴趣的位点,以过氧化物酶DAB标记第二位点。此外,Matsubara等人还开发出利用不同尺寸的纳米金属微粒进行双标记的技术。如果在免疫金及银增强之后采用四氧化锇,则可能造成对银的腐蚀,使得银颗粒的尺寸减小,或整个地去除它们。为避免这个问题,可以采取以下任何一个措施:
(1)降低锇的浓度;
(2)在银增强之后采用金调节;
(3)采用金增强剂以代替银。
如果不使用乙酸双氧铀,不太会出现银腐蚀的问题。如果有这样的问题,Burry和其合作者发现采用0.1 % OsO4代替1 %的,可很好地解决这个问题。
SiO2与Au纳米微粒在某些生物环境中具有明显的小尺寸效应,如Au纳米微粒能提高视黄醛薄膜的光电流和稳定性,SiO2与Au纳米微粒能提高葡萄糖氧化酶的活性及稳定性41-42。唐芳琼等人利用纳米金属微粒的比表面积大、表面反应活性高、吸附能力强等优点,把纳米微粒引入到葡萄糖氧化酶(GOD)固定化研究中,发现纳米微粒可显著提高GOD酶电极响应灵敏度和使用寿命。亲水、憎水的纳米金微粒均具有很好的导电性,在GOD与电极间传递载流子。同时,憎水纳米微粒所携带的反胶束可以为GOD提供一个水溶性微环境,减少在引入高分子辅助酶基质时带入的极性有机溶剂的接触,提高固定化酶的催化活性。
纳米磁性微粒在核酸研究中也获得了许多重要的应用。如纳米磁性微粒在mRNA、DNA的分离与纯化,以及在核酸杂交、扩增及测序方面的应用等。Rolfs等人采用磁性微粒作为固相载体对DNA测序的自动化进行了探索,其测序系统每周的分析能力可达30000~40000 个碱基。纳米磁性材料在治疗中的应用也受到广泛地关注。德国的Roland Felix研究组发明的癌症新疗法是基于将纳米铁氧体微粒用葡聚糖分子包裹,形成水溶性药物后注入肿瘤部位,在外加交流磁场作用下,使病灶部分升温至47℃来达到杀死癌细胞的目的。普通磁疗法利用电磁场对肿瘤部位进行加热,当温度高于40℃杀死癌细胞的同时,也损害到肿瘤周边的正常组织。采用新疗法,由于将肿瘤细胞和纳米微粒混合在一起,磁场作用能量较好地集中到肿瘤部位,使得对邻近组织的伤害大大减小,治疗的副作用得到控制。
另外,紫外光照条件下纳米TiO2微粒具有很高的氧化还原能力,能够降解微生物的有机质(特别是蛋白)从而杀死微生物。Cai等人将其用于癌细胞的治疗探索,结果表明,紫外光照射下10分钟,纳米TiO2微粒能杀灭全部实验癌细胞。
纳米材料及纳米技术在康复医学方面也获得了很大的应用,并且有些研发已进入临床实用阶段。由于纳米材料具有的特殊性质,例如由于纳米陶瓷中的晶粒尺寸为纳米量级,材料中内在的气孔与缺陷等尺寸大大减小,不易产生穿晶短断裂,大大提高了材料的韧性;而又因为晶界数量大大增加,有助于晶粒间的滑移,材料表现出独特的超延展性等,在人工骨、人工关节、人工齿、骨螺钉、听骨修复体以及许多人工器官等方面具有很大的应用前景。此外,目前纳米碳管的制备、性质及应用研究都有了很大的进展,由于该类材料的低密度、高比模量、高强度等特点在人工骨、人工肌腱、人工器官等方面也表现出很好的应用价值。
在纳米材料的生物医学应用中,已经广泛地注意到生物相容性研究的重要性。由于纳米观测技术的快速进步,生物相容性的研究也获得了很大的进展。
三、纳米器件在生物医学中的应用研究
纳米器件是指利用微细加工技术制造的,功能单元的特征尺寸为纳米量级,并且实现了一些新型功能的器件。例如,利用尖端直径小到足以插入活细胞内而又基本不干扰细胞正常生理过程的超微传感器,或纳传感器,又称为纳极,可以获取活细胞内足够的动态信息及反映整体的功能状态。
Fritz等人报道了一种特殊的传感器,这是利用因DNA杂交和受体-化合物键合到微细加工制备的悬臂梁上,而直接产生纳力学响应,导致表面压改变来制成的。形成阵列的悬臂梁表面通过选择的生物分子进行功能化。无论单个悬臂梁的非特异性响应有多大,悬臂梁的不同偏转提供出足够强的有关分子识别的信号。互补寡核苷酸的杂交显示两个12-mer的寡核苷酸间的单个碱基失配可清楚地检测到。类似的有关蛋白A与免疫球蛋白的相互作用的实验显示该纳力学传感器在检测生物分子识别方面具有很广泛的适用性。
除了研制可以测量某些微观结构性质的传感器之外,还需要研制一些具有动作功能的动作器,特别是基于仿生原理的和具有很好生物相容性的纳米动作器。Baughman等人基于单臂碳管的薄片制作成电动动作器,可产生的力超过自然的肌肉,具有比高模量铁电体高的应变。如同天然的肌肉,宏观动作器是由数十亿个单个的纳米尺度动作器组装而成。受激冲动的机理(由于电化学双层的充电的基于量化原理的膨胀)无须离子参加。因为离子因素限制了法拉导电聚合物动作器的寿命和动作速率。和通常的铁电动作器不同,可以几伏的小电压产生大的动作应变。通过测量可以预言,使用优化选择的纳米管薄片最终可提供具有实际意义的,且比目前任何已知技术都高的输出功率。Craighead对纳米机电系统(NEMS)的原理、加工技术,特别是在包括生物医学方面的应用前景作了很好的评述。
四、纳米药物体系
纳米材料与纳米技术在生物医学领域中应用的一个最重要的方面,就是药物纳米化及其新型功能研究,以及利用纳米技术制备出一些特殊用途的药物载体,达到缓释、靶向及可控释放等目的。这里将它们统一简称为纳米药物体系。
通常药物颗粒的纳米化可以提高药物的溶解度,从而可使发生作用的药物化学物质的数量增加许多,可用于开发治疗肿瘤、糖尿病、哮喘病等疾病的功效好、副作用极低的新药物;药物起作用的关键物质是活性成份,其中构造生命的分子构筑单元,如蛋白质、核酸、肽、碳水化合物等是重要的药物活性成份,通过纳米化技术将其加工成纳米颗粒或纳米分散体的成型和组装加工技术具有很大的实用价值。此外,药物颗粒纳米化后还可以将药物输送到身体任何极微细的组织管道(如血管、支气管道)及疾病变异的组织细胞(如癌肿瘤细胞)中,通常较大的药物颗粒是不能被输送到这些部位的,由此可大幅度地提高药物的定位性、时效性和功效,使疾病能更有效地控制和治疗。
目前已有不少有关药物颗粒纳米化技术的报道,如:采用油水乳液分散法制备技术,制备出的药物平均粒径为220~500nm;采用聚合物共混加工技术来制备蛋白质稳定化的药物活性组份纳米颗粒,其颗粒平均粒径为200nm以下;采用反溶剂沉淀法制备微米级药物颗粒,以及超临界反溶剂法制备纳米颗粒技术等。高明海等人发明了一种纳米级粒径超微化通用装置,可通过将物质进行超微破碎、乳化、均质、分散粒化成一定纳米粒径的材料。采用该装置处理的化妆品中的抗衰老成分(胎盘、SOD)等可容易地被皮肤吸收。此外,我国在中药纳米化也取得初步进展,徐辉碧等人将矿物中药雄黄纳米化,并发现不同粒径的雄黄对肿瘤细胞S180、上皮细胞ECV -304等的细胞毒性和诱导细胞凋亡作用呈现明显的尺寸效应。
纳米控制释放、缓释药物体系又简称为纳米控释药物系统。制备纳米控释药物系统的载体一般为高分子材料,主要包括合成的可生物降解的聚合物体系,如聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物,以及天然大分子,如天然的蛋白、明胶、多糖等体系为主。具体的方法,如使用不同的单体通过聚合反应的乳液聚合或界面聚合,以及超声乳化结合冻干技术等。
在纳米材料的生物医学应用中,已经广泛地注意到生物相容性研究的重要性。由于纳米观测技术的快速进步,生物相容性的研究也获得了很大的进展。
五、东南大学纳米生物医药学的主要研究工作介绍
光动力学疗法(PDT)是近年来医学界热切关注的新颖临床治疗手段。通常的PDT光敏药剂主要为卟啉类化合物,这类有机光敏药剂对生物体具有潜在的生物毒性且易累积。袁春伟教授等人使用TiO2纳米微粒替代传统的有机光敏药剂,不仅因为TiO2纳米微粒在无光照激发时对生物体无毒无害,而且因为TiO2纳米粒子具有较好的光催化活性,由此产生的自由基对恶性肿瘤有杀伤效应。他们主要从光敏药剂TiO2纳米微粒制备、光激发TiO2纳米微粒对蛋白质、核酸等生物大分子以及细胞、亚细胞结构的损伤来探讨TiO2纳米微粒对恶性肿瘤细胞杀伤机制研究。细胞凋亡是一种由基因调控的、受细胞外社会环境影响的主动连续的过程,它的失衡与人类的很多疾病有关,如癌症、艾滋病等,因而是目前生物学界的研究热点之一。在光电化学研究细胞凋亡的研究工作方面我们取得了较有意义的一批结果:制备了颗粒半径大小不同的二氧化钛、二氧化钛包覆磁性纳米微粒以及在此基础上的自组装功能膜体系;能够控制在一定活性氧剂量的作用下细胞主要以凋亡形式死亡并且发现了细胞凋亡对剂量的依赖关系;发现了肺腺癌细胞(A549)坏死与凋亡所分泌的不同的蛋白质,为今后更加深入地研究细胞凋亡的机理以及最终实现控制细胞凋亡的目标打下了良好的基础。
在基于纳米材料的分子免疫传感器以及研究方面,付德刚、沈耀春教授等人在胶体纳米颗粒的超瑞利散射实验中发现纳米材料具有很强的非线性光学系数,而且胶体金-抗体蛋白复合体系具有很强的超瑞利散射信号,可望由此发展出相关的分子免疫传感器以及可集成化的免疫传感与分析器件。
作为一种可靠、精确、低消耗的检测手段,生物传感器获得了广泛的应用。特别是,把生物活性分子固定于电极表面已成为其中重要的一环。鉴于以往各种固定方法的局限,袁春伟研究组合成了聚吡咯纳米微管并用于生物传感器的构造。微管膜呈高密度排列,管径数百纳米,且管壁多孔。它能封装大量的酶,减少底物和产物的扩散障碍。这种酶电极表现出理想的电化学性能。王雪梅教授等人开展了某些超分子与DNA分子相互作用方式及其识别模式的研究,采用一些常见的染料分子及一些抗肿瘤新药与DNA相互作用,同时借助一些纳米颗粒材料对液固界面化合物与单、双链DNA分子的作用进行研究,可提高相关检测的灵敏度。
张宇博士等人制备了一系列复合纳米杀菌材料,如AgZnO、AgTiO2、AgSi等,并成功地制备出一些具有广谱杀菌等功能的医用敷料。徐丽娜、周凯常等人制备出了一系列外覆纳米层厚度的核壳结构材料,在某些波段上具有很高效率的吸波性能,在医用仪器的电磁兼容以及人体电磁防护等方面具有明显的应用前景。
由于纳米相天然羟基磷灰石材料具有来源方便、价格低廉以及与生物亲和性很好等许多优点,吕晓迎教授等人已成功地制备出纳米尺度的天然羟基磷灰石材料,对其理化性质进行了表征,并正在进行进一步的医学应用技术研究。
在开展了纳米缓释及光控药物技术的研究方面,我们正在过去制备纳米脂质体技术的基础上利用纳米脂质微囊包裹药物,达到药物的平均释放效果,并试图改善药物的定向性;李新松教授等人采用自组装获得结构可控的高分子纳米结构材料,同时结合包裹胰岛素已初步形成纳米微粒的缓释胰岛素制剂技术;张海黔教授等人则采用偶氮苯的光致异构性能,将偶氮苯接入一种缓激肽中可达到利用光的可控释放药物的目的。
郑杰、张东生教授等人首次发现人的成纤维细胞和成纤维细胞分泌的角质细胞生长因子(KGF)可以诱导HPV永生化人宫颈上皮细胞在软琼脂上生长;发现KGF对HPV永生化人宫颈上皮细胞的病毒早期基因的转录起抑制作用,但可刺激HPV永生化人宫颈上皮细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的分泌; 他们还首次发现三氧化二砷可以选择性抑制HPV永生化人宫颈上皮细胞病毒致瘤蛋白的表达,并诱导该细胞凋亡,提示三氧化二砷体内治疗与HPV感染有关肿瘤的潜在应用价值。目前我们正在联合开展具有磁性内核,且外包金属氧化物纳米材料在若干肿瘤治疗中应用技术的研究。
六、结束语
以上将纳米科技在生物医学方面的应用研究与发展作了一个概略的介绍。由于发展的加速度很大,应用的涉及面也十分宽阔,故而只能是罗列非常少的一些情况,特别是纳米观测技术在生物材料纳米结构与功能,如生物单分子检测的研究目前进步非常大,没有篇幅在此全面地进行介绍。
致谢:衷心感谢国家自然科学基金、教育部青年教师教学科研奖励基金及骨干教师基金、江苏省自然科学基金、江苏省高技术项目及江苏省计委相关科研项目对我们工作的支持;衷心感谢本校纳米科技研究中心,特别是生医系教师、研究生们相关研究工作的辛勤努力与不断取得的进展。