【摘要】 目的:探討hTERC基因在预测宫颈上皮内瘤变Ⅰ级进展和转归中的价值,为临床预测宫颈上皮内瘤变Ⅰ级进展和转归提供理论依据。方法:选取本院2011年12月-2016年12月收治的206例宫颈上皮内瘤变Ⅰ级(CINⅠ)进行分析,随访后根据病理学确诊情况分为进展组、持续组和转归组,采用Fish技术检测不同组的hTERC基因扩增情况。结果:206例宫颈石蜡包埋病理标本,所有患者均成功杂交,其中56例进行了二次杂交,杂交成功率100%。206例CINⅠ组患者随访后发现,hTERC基因扩增阳性114例,其中进展组67例、持续组30例、转归组17例。在进展组中hTERC基因扩增阳性67例,占100%,持续组中基因扩增阳性30例,占49.18%,转归组中基因扩增阳性17例,占21.79%;经Fisher确切概率法,三组转归阳性率相比,差异有统计学意义(P<0.05)。经Fisher确切概率法,三组hTERC基因扩增异常信号比的细胞比例比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:hTERC基因或可成为预测CINⅠ病程进展程度的一种生物学指标,可为临床医师诊断和治疗提供依据,从而更大程度地做到对患者的早诊、早治,避免对患者造成更大的伤害。
【关键词】 宫颈癌; 宫颈上皮内瘤变; 人类染色体端粒酶RNA基因; 荧光原位杂交技术; 石蜡包埋切片
【Abstract】 Objective:To explore the value of hTERC gene in predicting the progression and outcome of cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅰ,and to provide theoretical basis for predicting the progression and outcome of cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅰ.Method:A total of 206 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CINⅠ ) were selected in our hospital from December 2011 to December 2016.The patients were divided into progress group,continuous group and control group,according to the pathologic diagnosis,Fish technique was used to detect the hTERC gene amplification in different groups.Result:206 cases of cervical paraffin embedded pathological specimens,all patients were successfully hybridized,of which 56 cases were secondary hybridization,hybridization success rate of 100%.206 patients with CINⅠ were followed up and found that 114 cases of hTERC gene amplification were positive,including 67 cases in the progress group,30 cases in the continuous group and 17 cases in the control group.In the progress group,the positive rate of hTERC gene amplification was 67 cases(100%),the continuous group was positive in 30 cases(49.18%),and the control group was 17 cases (21.79%),by Fisher exact test method,the difference between the three groups was statistically significant(P<0.05).The Fisher exact test,the proportion of cells in the abnormal signal amplification of hTERC gene than the three groups compared,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion:The hTERC gene may be a biological indicator for predicting the progression of CINⅠ,which can provide a basis for the diagnosis and treatment of clinicians,so as to achieve a greater degree of early diagnosis and early treatment of patients,to avoid causing greater harm to patients.
【Key words】 Cervical cancer; Cervical intraepithelial neoplasia; Human chromosome telomerase RNA gene; Fluorescence in situ hybridization; Paraffin-embedded sections
First-author’s address:The People’s Hospital of Linyi Economic and Technological Development Zone,Linyi 276023,China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2017.21.008
随着环境和社会压力的增加,目前女性宫颈癌的发病率占据女性恶性肿瘤的第2位,据现有的流行病学调查显示,在我国每年大约有53万新发病例,死亡人数约30万,严重威胁妇女的健康,降低了患者的生活质量[1]。文献[2-3]研究发现,宫颈癌进展一般需要10~20年的时间,病变从HPV感染最终发展成宫颈癌,由此可认为宫颈癌是一种可预防的恶性肿瘤。目前對于宫颈癌的检查大部分采用三阶段进行筛查,主要包括宫颈细胞学检查、人类乳头状病毒DNA的检测以及阴道镜的检测。但各种检测方法有着自己的局限性,存在敏感率低,或特异性不高的现象。因此需要探索一种新的临床指标来预测宫颈癌的发生及发展并协助上述检查方法[4]。
随着分子生物学的发展,目前研究发现,hTERC基因可阻止细胞的凋亡,导致肿瘤的发生,是宫颈癌的发病机制之一[5]。本研究探讨hTERC基因在预测宫颈上皮内瘤变Ⅰ级进展和转归中的价值,为临床预测宫颈上皮内瘤变Ⅰ级进展和转归提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取本院2011年12月-2016年12月收治的206例宫颈上皮内瘤变Ⅰ级(CINⅠ)进行分析,年龄38~58岁,平均(43.2±5.1)岁,所有患者均无急性阴道炎、宫颈炎以及就诊前24 h内无性生活,无长期性激素暴露史,非月经期、妊娠期和哺乳期;获取标本前接受过物理或化学治疗的患者。
1.2 方法
1.2.1 标本的制作 所有患者均进行宫颈组织的取材,且进行石蜡包埋,然后进行厚度为2 μm的连续切片6张,并将玻片经70 ℃的过夜烘烤。
1.2.2 荧光原位杂交技术(FISH)检测 将事先制作好的标本置于二甲苯中进行脱蜡处理,15 min/次,共2次;随后放入100%乙醇中,10 min;然后将玻片在室温下依次经100%乙醇3 min、85%乙醇
3 min、75%的乙醇3 min;将其放入灭菌纯化水中室温洗涤3 min,取出玻片,再将其放入灭菌纯化水中100 ℃煮片20 min进行复水;复水后将玻片置于2×氯化钠柠檬酸钠清洗缓冲液中漂洗玻片
5 min,室温晾干,进行松解和消化;将玻片放置37 ℃的杂交仪器中,滴加适量的蛋白酶K工作液,消化10 min,室温下于2×氯化钠柠檬酸钠清洗缓冲液中漂洗玻片2次,5 min/次;将玻片依次置于70%、85%和100%乙醇中各脱水3 min,自然干燥玻片[6]。Fish检测步骤包括(1)离心:从-20 ℃冰箱中取出杂交液,混匀后进行离心[6-7];(2)杂交:加入10 μL的杂交液,盖上22 mm×22 mm的盖玻片,用封片胶沿盖玻片边缘封片,用将玻片放在83 ℃的杂交仪上,变性5 min,42 ℃复性16 h;(3)洗涤:将玻片取出,用镊子轻轻撕去橡皮胶,移去盖玻片,玻片放入47 ℃的2×氯化钠柠檬酸钠清洗缓冲液中洗涤5 min,然后放入47 ℃的0.1% NP-40和2×氯化钠柠檬酸钠清洗缓冲液中洗涤
5 min,将玻片室温下浸泡在70%乙醇中脱水3 min,自然干燥玻片;(4)观察:滴加10 μL DAPI复染剂到载玻片的组织中,盖上盖玻片,轻压,避免产生气泡,在暗处存放,在荧光显微镜下选择适合的滤光片进行观察。
1.2.3 FISH结果的判断 用FISH分析软件进行图像分析。每例样本随机计数100个细胞,计算显示异常信号细胞数所占计数细胞的百分比。杂交结果标记颜色绿∶红[8],正常信号细胞为绿色及红色信号各2个,即2∶2;扩增异常信号细胞为绿色信号≥2个,红色信号>2个,即2∶3、2∶4、3∶3、4∶4以及高拷贝型(N:≥5,即绿色信号≥2个,红色信号≥5个)。
1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析。三组间的阳性率比较采用Fisher确切概率法,其检验水准设为α=0.05;两两比较采用Fisher确切概率法,检验水准设为α=0.05/3=0.017。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 hTERC基因扩增阳性情况与CINⅠ进展及转归的关系 本研究中206例宫颈石蜡包埋病理标本,所有患者均成功杂交,其中56例进行了二次杂交,杂交成功率100%。206例CINⅠ组患者随访后发现,hTERC基因扩增阳性114例,其中进展组67例、持续组30例、转归组17例,见表1。
2.2 hTERC基因扩增阳性情况与CINⅠ进展及转归的关系 在进展组中hTERC基因扩增阳性67例,占100%(67/67),持续组中基因扩增阳性30例,占49.18%(30/61),转归组中基因扩增阳性17例,占21.79%(17/78);经Fisher确切概率法,三组转归阳性率相比,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 hTERC基因扩增异常信号细胞及异常信号比类型与CINⅠ进展及转归的关系 206例宫颈石蜡包埋病理标本,每例计数100个细胞,进展组67例中hTERC基因扩增异常信号细胞数3371个,扩增异常信号细胞比例为50.31%;持续组30例,hTERC基因扩增异常信号细胞数678个,扩增异常信号细胞比例为22.60%;转归组17例,hTERC基因扩增异常信号细胞数112个,扩增异常信号细胞比例为6.59%;经Fisher确切概率法,三组hTERC基因扩增异常信号比的细胞比例比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
尽管医学诊疗技术的不断进步,但是宫颈癌仍然是严重威胁妇女健康的恶性疾病之一,其发病率较高,居恶性肿瘤发病率的第2位,仅次于乳腺癌,且全球发病率呈现逐年增加的趋势,在发展中国家尤为突出。且目前宫颈癌发病有明显年轻化趋势,严重威胁着女性的健康和生命[1-9]。在发达国家,由于开展对宫颈癌的筛查,对宫颈癌实施早期的诊断和治疗,目前死亡率已下降50%,而在发展中国家,大多数宫颈癌发现时已经是晚期。这说明早期诊断和治疗至关重要[2]。
现代细胞遗传学和分子生物学研究表明,人体大多实体肿瘤细胞一般表现为染色体的不稳定性,其不仅数目异常,而且在某种程度上其染色体结构也有着一定的异常表现。在对宫颈癌的研究中显示,常见于染色体3q的增加和2、3、4、6P与11q的缺失[10-11]。文献[12-14]研究表明,宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增。其中,人类染色体端粒酶基因(hTERC)作为端粒酶RNA成分的编码基因,其异常扩增可能为导致宫颈癌的因素之一。该基因的扩增可阻止细胞凋亡,因而可导致肿瘤产生[15-17]。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术是目前检测这一基因扩增的标准方法[18]。目前,FISH检测方法已广泛地用于产前、产后遗传病诊断及血液肿瘤、实体瘤等方面的检测。其检测样本较为广泛,主要包括羊水、绒毛、流产组织、外周血、骨髓、体液及各种肿瘤组织等[18-19]。
本研究通过FISH技术对宫颈脱落细胞TERC基因检测,结果发现,206例CINⅠ组患者随访后发现,hTERC基因扩增阳性114例,其中进展组67例、持续组30例、转归组17例。且研究还发现,在进展组中hTERC基因扩增阳性67例,占100%(67/67),持续组中基因扩增阳性30例,占49.18%(30/61),转归组中基因扩增阳性17例,占21.79%(17/78);经Fisher确切概率法,三组转归阳性率相比,差异有统计学意义(P<0.05)。
FISH技术操作相对简单,重复性好、稳定,并具有较好的灵敏性及特异性,并且不需要细胞培养,可以用于间期细胞[20-21]。本研究对宫颈上皮内瘤变患者不同进展的阶段进行FISH分析检测,结果发现,206例宫颈石蜡包埋病理标本,每例计数100个
细胞,进展组67例中hTERC基因擴增异常信号细胞数3371个,扩增异常信号细胞比例为50.31%;持续组30例,hTERC基因扩增异常信号细胞数678个,扩增异常信号细胞比例为22.60%;转归组17例,hTERC基因扩增异常信号细胞数112个,扩增异常信号细胞比例为6.58%;经Fisher确切概率法,三组hTERC基因扩增异常信号比的细胞比例比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
综上所述,hTERC基因或可成为预测CINⅠ病程进展程度的一种生物学指标,可为临床医师诊断和治疗提供依据,从而更大程度的做到对患者的早诊、早治,避免对患者造成更大的伤害。
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(收稿日期:2017-04-25) (本文编辑:张爽)