学生命科学学院陈力教授馈赠,植物材料为三倍体组培苗,经炼苗后移栽至天津农学院试验田,常规大田管理,由于是组培苗移栽,在生长季植株陆续开花。
1.2 方法
1.2.1 细胞学压片 丹参三倍体花蕾生长早期,根据花蕾生长的长短不同进行取材,经卡诺氏固定液固定24 h后转入70%乙醇溶液中,4 ℃条件下保存备用。采用常规压片法进行减数分裂染色体压片,选取未成熟的花药(长度在1~3 mm之间),用自来水浸泡、清洗20 min以上,然后用2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶的混合酶液(2∶1)在28 ℃对材料酶解30 min,水洗后用1 mol/L HCl 60 ℃水解10 min,自來水冲洗3次,浸泡20 min,卡宝品红染色10 min。Olympus BX53显微镜镜检,Spot Idea CCD相机拍照。
1.2.2 石蜡切片制作和解剖结构观察 以丹参三倍体不同发育时期的花药为试材,用常规石蜡制片法将固定好的材料,分别进行石蜡包埋、制片,显微结构观察。梯度乙醇脱水,二甲苯透明,爱氏苏木精整染,Leica RM2265切片机切片,切片厚度8~10 μm,Leica DM 4000B显微镜镜检,观察丹参三倍体不同发育时期的花药解剖结构,Leica DFC450 C相机拍照。
1.2.3 花粉显微观察和萌发试验 参考张志良等[9]的方法;取即将开放的花朵,用镊子夹出花药使之铺展在硫酸纸上阴干,待花粉自然散出后收集备用。离体萌发法采用培养基为0.1 g/L硼酸+10%蔗糖+0.5%琼脂,倒入适量培养基于载玻片中央,待其稍凝固后用玻璃棒蘸取少量花粉均匀地抖落在上面,再放入湿培养皿中,保鲜膜封皿后置于恒温培养箱中培养,培养温度为(252)℃,培养8 h后统计数据。所有处理均重复3次,每个重复选择10个视野计数。Leica DM 4000B显微镜镜检,Leica DFC450 C相机拍照。
2 结果与分析
2.1 丹参三倍体植株及花器形态正常
为了解三倍体丹参植株的生长状况,本研究对栽培丹参三倍体植株进行了生长发育观测。丹参三倍体植株生长健壮,从侧根繁殖开始,营养生长期约3个月,植株茎叶繁茂,长势旺盛,株高可达80 cm,进入生殖生长后,植株正常开花,轮伞花序具多朵花,密集组成长及15 cm的顶生总状花序,花冠蓝紫色,唇形,2枚雄蕊形态正常,未出现失水、干瘪等萎缩现象(图1),说明三倍体植株经营养生长后,能够适时开花,雄蕊2枚正常状,另外2枚退化不显著;雌蕊2心皮,形态表现正常,但不收缩而分裂为4枚裂片。我们观察了丹参二倍体的植株和花器官形态,与三倍体比较,无明显差异。
2.2 丹参三倍体花粉母细胞减数分裂异常
三倍体丹参的体细胞数为24条(2n=3x=24),在前期I观察到三价体、二价体和单价体,构型为2III+6II+6I(图2A),在三倍体丹参的花粉母细胞减数分裂后期I,同源染色体彼此分开,分别向两极移动时,观察到14个花粉母细胞出现落后染色体(图2B),7个出现同源染色体分向不均等(图2C),6个出现染色体桥(图2D),分别占观察总数124个花粉母细胞的比例为11.2%、5.6%和4.8%。
2.3 丹参三倍体花粉母细胞减数分裂结果产生多分体异常
丹参三倍体在减数分裂后期Ⅱ,观察到78.30%的细胞为四分体(图3A),少量含有微核的异常四分体(图3B)、三分体(图3C)、二分体(图3D)等特殊类型,说明对于丹参三倍体而言,大多数花粉母细胞能够进行正常减数分裂,一部分细胞不能形成四分体,减数分裂结果不正常,可能直接导致不育。
2.4 丹参三倍体花药切片显示花粉粒形态异常
花粉母细胞减数分裂产生四分体,再发育形成单核花粉粒,进而形成2或3细胞成熟花粉粒。石蜡切片结果显示,丹参三倍体成熟花药中花粉粒的形态结构产生变异,与正常发育花药中的花粉粒形态比较,这些花粉粒中的一部分呈椭圆形、边缘规整,而另外一部分则形状不规则,边缘凹陷,产生畸形,呈败育状态(图4)。统计结果显示,约54.5%的花粉粒为畸形花粉粒,约占花粉粒总数的一半。
2.5 丹参三倍体花粉萌发率极低
鉴于丹参三倍体花粉粒部分形态畸变,我们进行了花粉萌发试验。由于无法区分在上述石蜡切片中观察到的畸形花粉粒和正常形状花粉粒,我们采集正常形状的花药,对其中的花粉粒进行了萌发试验。试验结果表明,丹参三倍体的花粉粒基本不萌发,极个别从萌发孔产生萌发迹象,但并不长出花粉管,其长度过小,无测量意义(图5)。我们的花粉萌发试验没有区分出畸形花粉粒,但结果是所有花粉粒均不萌发。
3 讨论
天然加倍的多倍体植物在自然界中广泛存在,并且在进化历程中逐渐完成二倍体化而成为新的物种。由于多倍体优势的存在,这些新物种具有自身的生长、发育、遗传等优势,在自然竞争中扩大了种群繁衍范围,增强了适应性,并被人类利用而得以延续下来[10]。获得三倍体的途径有三种:一是雌雄配子之一不减数,二者结合后产生;二是两个精子同时进入胚囊与卵细胞结合;三是用四倍体和二倍体杂交获得[11]。三倍体丹参就是通过四倍体和二倍体杂交途径获得的,二倍体花粉母细胞减数分裂正常[8]。
由于在减数分裂过程中配子染色体数目不平衡,三倍体是高度不育的。但也有例外,如风信子、马铃薯、苹果、草莓百合、玉米、番茄、还阳参等[12]。此外,百合三倍体虽为雄性不育,但可以作为母本与二倍体和四倍体杂交,产生后代[13]。可见,三倍体的育性具有一定的物种特性,其机理仍不清楚。减数分裂过程紊乱是人们公认的三倍体不育的主要原因,但减数分裂的过程和结果会产生不同的染色体和细胞行为表现类型。我们的结果表明,丹参三倍体在减数分裂过程中产生了多种异常染色体和细胞行为表现,如出现落后染色体、染色体不均等分向两极、染色体桥等,减数分裂结果产生三分体、微核等。这些结果与已有的其他三倍体减数分裂观察相似[14-15]。试验结果还表明,丹参三倍体花粉粒形态异常,产生畸变,且其萌发率极低。以此推断,丹参三倍体在生长发育过程中,由于减数分裂过程中染色体数目不平衡,在减数分裂过程中产生各种畸变、异常的染色体和细胞的行为表现,是造成其不育的主要原因。此外,通过观察、检测、分析可见,丹参三倍体雄配子产生过程中,存在各个发育环节的异常,从减数分裂过程到减数分裂结果,从花粉粒形态到花粉萌发,这些异常表现导致了雄性不育,由于雄性不育,丹参三倍体无法进行有性生殖,只能通过营养繁殖来繁衍后代。在生产实践中可以通过根系分枝来进行营养繁殖,同时保留三倍体的营养生长特性。
三倍体是由四倍体和二倍体杂交获得的,在多倍化和杂交过程中,整合了两个倍性不同的基因组,会由于三倍体阻遏(triploid block)而导致杂交种子不能正常发育或产生无活力的种子[16]。本研究表明丹参三倍体植株生长正常,但由于其花粉母细胞减数分裂中产生落后染色体、染色体不均等分向两极、染色体桥、三分体、微核等异常情况,使得部分花粉粒形状不规则,边缘凹陷,产生畸形,进而败育,这是丹参三倍体不育的主要因素,但丹参三倍体减数分裂过程中基因表达的遗传调控机制仍不清楚,需要进一步证实。
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