抗体得纯化
第一节 硫酸铵沉淀法
基本原理
疫免得要主将以可法方此用、质白蛋化纯分部与缩浓中剂制粗量大从于用可法淀沉铵酸硫ﻫ球蛋白从样品中分离,就是免疫球蛋白分离得常用方法。高浓度得盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面得水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来、各种蛋白质得溶解度不同,因而可利用不同浓度得盐溶液来沉淀不同得蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱与度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小与不易使蛋白质变性而应用最广。
ﻫ试剂及仪器 ﻫ· 组织培养上清液、血清样品或腹水等
· 硫酸铵(NH4)SO4
· 饱与硫酸铵溶液(SAS)
· 水馏蒸ﻫ · )一录附见( )钠氮叠 L/g2。0 含(SBPﻫ· 袋析透ﻫﻫ · 机心离速超ﻫ· 计 Hpﻫﻫ·
器拌搅力磁ﻫﻫ球疫免得同不种各。淀沉铵酸硫得体抗绍介来例为液清上养培织组或水腹以ﻫﻫ 骤步验实ﻫ蛋白盐析所需硫酸铵得饱与度也不完全相同、通常用来分离抗体得硫酸铵饱与度为 33%—50%。
ﻫ )SAS(液溶铵酸硫与饱制配、一ﻫ将767g(NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到 1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到 pH7、0。此即饱与度为 100%得硫酸铵溶液(4。1 mol/L, 25°C); ﻫ其它不同饱与度硫酸铵溶液得配制见表 1;
淀沉、二ﻫﻫ、1ﻫ ;片碎胞细去除,nim 03 心离 g´000 02)水腹如(品样ﻫ2、保留上清液并测量体积; ﻫ3、边搅拌边慢慢加入等体积得 SAS到上清液中,终浓度为 1:1(v/v);
4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。
析透、三ﻫ 1、蛋白质溶液 10 000´g 离心 30 min(4°C)。弃上清保留沉淀;
2、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS—0、2g/L 叠氮钠中、沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0、2g/L 叠氮钠透析 24-48 小时(4°C),每隔3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨;、3
。量含质白蛋中液清上定测,心离液析透ﻫﻫ 应用提示
ﻫ一、先用较低浓度得硫酸氨预沉淀,除去样品中得杂蛋白、
1、边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中,使浓度为 0、5:1 (v/v);
、2ﻫ ;)C°4(夜过或 时小6拌搅上器拌搅力磁在放液溶将ﻫ3、3000´g 离心 30 min(4°C),保留上清液;
4、上清液再加SAS 到 0、5:1 (v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS,同前透析,除去硫酸氨;
5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白就是非常有效得;
;)1表考参量用氨酸硫(析盐行进氨酸硫体固用可,大过积体免避为、二ﻫﻫ
献文考参ﻫﻫ 。体抗得化纯步一进更到得可,用使合结术技析层与法淀沉氨酸硫、三ﻫ1、 Burd, R、S。, Raymond, C、S., Ratz, C。
A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk、 Hybridoma 12, 135. 、2。G、Tﻫﻫ库珀着,徐晓利主译《生物化学工具》 人民卫生出版社出版(1980),353。
( )泉夏ﻫ 表 1、室温下硫酸氨饱与度由起始浓度(S1)提高到终浓度(S2)时需加硫酸氨得量(g/L) %0ﻫﻫﻫﻫﻫ 10%
20% ﻫ25%
ﻫ%03ﻫ33% ﻫ%53ﻫﻫ40% ﻫ%05ﻫﻫ%54ﻫﻫ55%
60%
%56ﻫ %07ﻫ 75% %08ﻫﻫ %09ﻫ56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767
295 494 944 604 563 623 882 152 612 381 051 731 811 68 75ﻫ649 ﻫ29 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 619
30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 58321 49 26 03 91ﻫﻫ7 162 198 235 273 314 356 449 546 ﻫ12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 522
ﻫ605 114 913 872 832 002 461 921 49 36 13ﻫ
31 63 97 132 168 205 245 285 375 469
32 65 99 134 171 210 250 339 431
33 66 101 137 176 214 302 392 ﻫ33 67 103 141 179 264 353
413 722 341 501 96 43ﻫ 34 70 107 190 275
35 72 153 237
ﻫ891 511 63ﻫ77 157 ﻫﻫﻫ 97
理原本基ﻫﻫ 法析层换交子离 EAED 节二第ﻫ化纯地效有常非以可用使合联法淀沈氨酸硫与,法方规常得化纯质白蛋是就析层换交子离ﻫ抗体。
被以可质白蛋得荷电负带,时柱 EAED 过通液溶质白蛋当,剂换交子离阴种一是就 EAEDﻫDEAE吸 于大值 Hp 择选可时体抗化纯。出流液溶随而附吸被不则质白蛋得荷电正带,附ﻫﻫ待纯化抗体等电
盐加增用后然,上剂换交子离 EAED 于附吸键价电过通以可荷电负带体抗时此,液冲缓得点ﻫ浓度
ﻫ得方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱,也可以用不连续梯度(分段洗脱)法洗脱。本文以 ﻫ
。法方此绍介来例为化纯得 bAm中水腹ﻫ试剂及仪器
ﻫ· 抗体样品(小鼠腹水或经硫酸氨沉淀得抗体)
· DEAE 离子交换剂(阴离子交换剂) ﻫ· 层析柱(2、5cmÆ ´ 20 cm)
· lCaN L/ lomm 53+ 8、8 Hp lCH—sirT L/lomm52:A 液冲缓ﻫ· 缓冲液 B:25mmol/L Tris—HCl pH 8.8 +70mmol /L NaCl · 缓冲液 C:25mmol/L Tris—HCl pH 8.8 +500 mmol /L NaCl
·
8.8 Hp lCH-sirT L/lomm52:D 液冲缓ﻫ · PBS (见附录一)
· )000 01 OC WM( 袋析透ﻫ · 磁力搅拌器
· 蠕动泵与部分收集器 ﻫ· 紫外检测仪
· 梯度发生器
· 电导仪 ﻫ· pH 计 ﻫ· 离心机
实验步骤
;作操室冷在可,行进 C°4 在好最程过析层个整ﻫﻫ 1、抗体样品对缓冲液 B 透析过夜(4°C); 、2换交洗 A 液冲缓积体倍02 用、衡平 A液冲缓用后然。剂换交子离EAED 理处明说按ﻫ剂,可用过滤或离心法反复洗到流出液得电导率等于缓冲液A; 、3、、柱析层入装,中 A 液冲缓在浮悬剂换交子离 EAED得好理处将ﻫ4缓得积体等用ﻫﻫ冲液 D 稀释透析过得抗体样品,使之与缓冲液 A 得离子强度一致;、5 01 品样得后释稀ﻫﻫ000´g 离心 10 min(4°C),除去沉淀变性得蛋白质;、6紫及器集收分部、泵动蠕与柱析层ﻫﻫ外检测仪连接; 、7洗质白蛋得附吸未将,nim/lm1 柱洗 A 液冲缓用后然,柱上速流 nim/lm1以品样体抗ﻫ出。直到流出液在 280 nm 得吸光度小于 0.05;
8、吸附得蛋白质,用连续增加 NaCl 得浓度来洗脱。用线性梯度缓冲液(35-500 mmol/L NaCl)或分段缓冲液(35、70、140、280、500 mmol/L NaCl)洗脱、流速 1ml/min ,分部收集洗脱液 2ml / 管 (图 2-4—1);
9、椐紫外检测结果,将抗体峰部分合并。装入透析袋对 PBS(含 0、2g/L 叠氮钠)4°C 透析或冷冻(视抗体得稳定性而定);
10、 DEAE离子交换剂可按照商品说明再生使用。
图 2-4-1 DEAE离子交换柱层析纯化小鼠 IgG
流速:1ml/min 样品:0、5ml 腹水
ﻫ检测方法
ﻫ1、大部分小鼠得单克隆抗体 IgG 可在50—200mmol/L NaCl浓度之间洗脱。
ﻫ2、可用 SDS—PAGE 或定量免疫学方法(RIA、ELISA)检测各部分洗脱液得抗体存在及效价。
明说及点要验实ﻫ
1、要得到满意得分离结果,每 ml DEAE 离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过 10mg。
、2ﻫ 。果结化纯得好更到得可,品样为作水腹鼠小替代体抗得化纯步初淀沉铵酸硫经用ﻫ3、如抗体与 DEAE离子交换剂不能有效得结合,可将起始缓冲液得 pH 提高0、1 个单位,
直到可以有效结合为止。
、4m2-5。0 集收管每液脱洗。集收与样上工手用可,器集收分部与泵动蠕得用合有没果如ﻫl ,然后用分光光度计测定各管 280nm 波长得吸光度值。
5、该方法可按比例扩大。用适合于高流速得大柱与相应得交换剂来纯化大量得蛋白质样品。
ﻫ 献文考参ﻫﻫ、1.J ,nialuoP-yelrahC dna 。E ,ittehcsoB ,、G ,reihtroCﻫﻫ(1984) Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatography J。
Immunol。
Meth 、 66, 75-79。
2、张保真编译西安医科大学出版(1986)《免疫组织化学理论与技术》 69—71。
(ﻫ)泉夏ﻫ
ﻫ第三节 羟磷灰石层析纯化抗体
基本原理
与 +2aC得面表体晶其与为认常通,理机得质白蛋附吸]2)HO(6)4OP(01aC[石灰磷羟ﻫPO43- 两种基团相关。因为带电基团紧密排列于晶体表面,可能通过偶极子之间得相互作用来吸附蛋白质。样品被吸附剂吸附后,用适当得洗脱液(较高浓度得盐溶液)冲洗,可使之解析。解析下来得物质在流经层析柱得过程中向前移动,遇到前面新得吸附剂可再被吸附、在反复得吸附—解析—再吸附—再解析得过程中,由于待分离物质与吸附剂之间得吸附能力不同,它们沿洗脱液流动方向移动得速度也不相同,所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而被分离。抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。
试剂及仪器
ﻫ· 抗体样品(腹水或培养上清液)
· )售有 etitapalyxordyH(石灰磷羟ﻫ· )mc 02 ´ Æmc5。2(柱析层ﻫﻫ·缓附吸ﻫﻫ冲液:20mmol/L 磷酸钾缓冲液 pH6.8 含 30mmol /L NaCl · 洗脱缓冲液:500mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6。8 含 30mmol /L NaCl
· )1录附见( SBPﻫ · 透析袋 (MW CO 10 000) ﻫ· 磁力搅拌器 ﻫ· 蠕动泵与部分收集器
· 紫外检测仪 · 器生发度梯ﻫﻫ ·
机心离ﻫ、 骤步验实ﻫ1、柱装后合水分充之使,中液冲缓附吸于浮悬石灰磷羟将:备准得柱石灰磷羟ﻫﻫ用 10´ 柱体积得吸附缓冲液洗柱; 、2,释稀倍01 液冲缓该用或夜过析透液冲缓附吸对C°4 在先品样得体抗含:理处预得品样ﻫ再将透析或稀释后得样品 4 000´g 离心 15min(4°C); 、3ﻫ ;接连柱析层与器集收分部与仪测检外紫、泵动蠕将:装安器仪ﻫ4、上样:将样品上清液以 1ml/min得流速加到柱上,然后用 20´ 柱体积得吸附缓冲液洗柱;、5用是就种一:种两有法方得用常、脱洗体抗将以可度浓得盐酸磷高提:脱洗得体抗ﻫﻫ
梯度发生器进行线性浓度梯度洗脱,浓度为 20—500 mmol/L 得磷酸钾缓冲液;另一种方法就是用不连续浓度梯度洗脱,例如可以用35、70、140、280 与 500 mmol/L得磷酸钾缓冲液依次分段洗脱。收集洗脱液 2ml / 管(图2-4-2); ﻫ6、合并洗脱液中含抗体得部分(见下面检测)对PBS 透析。根据抗体得稳定性 4°C或冷冻防腐(0。2g/L 叠氮钠)保存; 1:速流ﻫﻫGgI体抗隆克单化纯析层柱石灰磷羟 2-4—2 图ﻫﻫml/min 样品:腹水 1ml
法方测检ﻫﻫ 、1 。脱洗间之度浓钾酸磷 L/lomm004—002在常通 GgI 体抗隆克单ﻫ 、2ﻫ
。体抗得液脱洗分部各测检,)ASILE、AIR(法方学疫免量定或 EGAP—SDS用可ﻫ应用提示
1、每 100ml 羟磷灰石可吸附大约 500 ml细胞培养上清液或 3 ml 得腹水或血清中所含得抗体。、2:寸尺型典(间之 1/51—1/5 在以可 径直/长柱 得合适较柱石灰磷羟用使ﻫﻫ2。5cm Æ ´20 cm 柱长)。
3、在吸附过程中应避免有对钙得亲与力大于磷酸盐得物质(如 EDTA 与柠檬酸等)得存在,以免减少羟磷灰石得吸附容量。、4复重后生再衡平液冲缓附吸用以可柱石灰磷羟得过用ﻫﻫ使用。或加入甲苯(0、03%, v/v)或叠氮钠(0、2g/L)储存。
、5光分用并,管 / lm2 液脱洗集收与样加工手可,器集收分部与泵动蠕得适合有没果如ﻫ光度计
测定各管在 280nm 波长得吸光度。
、6 。质白蛋它其化纯来用可也程过脱洗与附吸得似类法方本与ﻫ
献文考参ﻫ Bukovsky, J。
and Kennett, R、H、 (1987) Simple and rapid purification of monoclonal antibodies from cell culture supernatant and ascites fluids by hydroxylapatite chromatography on analytical and preparative scales。
Hybridoma 6 ,219—228.
(夏泉)
ﻫ第四节 抗体得辛酸纯化法
ﻫ基本原理 与可 ,酸辛入加中水腹得鼠小及中清上养培得 GgI 有含 或清血兔或羊、人在ﻫﻫ其中大部分蛋白质形成沉淀,而对IgG 得性质没有影响,因此就是纯化IgG 得有效途径。沉淀后经离心即可获得 IgG。辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物得形成,但与其相同,所得得抗体纯度不够,还需用其它方法以进一步提高其纯度。
器仪及剂试ﻫ 清上养培胞细或水腹 sﻫ s 0。06 mol/L 醋酸钠缓冲液(pH4、0)(见附录1)
lCH N1 sﻫ )dica cionatco-n,酸碳八-正 (酸辛 sﻫﻫ )录附见(SBP sﻫﻫHOaN N1 sﻫs 透析袋 (MWCO 10,000) ﻫ 器拌搅磁电 sﻫ
s 离心机
ﻫ操作步骤
1。
用烧杯加 20ml 0.06 mol/L 醋酸钠缓冲液(pH4。0)到 10ml 腹水或细胞培养上清中; .2 ;1 表见参量用体具,拌搅力用时同酸辛加滴后,8、4 到Hp 节调lCH N1用ﻫﻫ 3。
在室温下继续搅拌 30 分;
4. 5,000 × g 室温离心30 分,保留上清; .5 ;7.5 到Hp 节调 HOaN N1 用ﻫﻫ。6有含ﻫﻫIgG 得上清对 PBS透析,然后分装、置—20℃保存、
ﻫ表1 沉淀不同来源 IgG 得辛酸参考用量
)清上或水腹 lm01 每(量用酸辛 源来GgIﻫﻫ lμ004 鼠 小ﻫ 人 700μlﻫ lμ007 羊ﻫﻫ兔 750μl ﻫﻫ质量检察
上清中IgG 得纯度可用 SDS-PAGE 分析及合适得酶标免疫测试法测定其免疫活性来确定、
上清中可能存在少量杂质,可通过DEAE离子交换层析除去。
献文考参ﻫﻫ。1ﻫﻫRusso,C、, Callegaro,L。,Lanza,E。, and Ferrone,S。
(1983) Purification of IgG monoclonal antibody by caprylic acid precipitation、 J. Immunol. Meth。
65,269-271 .2 fo noitalosi ehT )9691( .R,narduA dna 、M,hcubnaietSﻫﻫIgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid. Arch.Biochem。Biophys、 134, 279-284
ﻫ(朱正美) ﻫ
体抗化纯滤过胶凝 xedahpeS 节五第ﻫ 基本原理
ﻫ凝胶过滤又称分子筛层析。就是一种借助分子筛效应将分子大小不同得混合物进行分离得方法。交联葡聚糖凝胶Sephadex 就是常用得层析介质、它就是一种含有许多网眼得球形小颗粒,网眼大小分布均一。当分子大小不同得混合物通过凝胶柱时,其中较大得分子不能进入凝胶网眼,将毫无阻力或阻力很小地随洗脱液流出,而小分子物则能扩散进入网眼,被阻滞在层析柱上,分子量越小,扩散出来所耗时间就越长、因此分子大小不同得 MoAb 可以借助分子筛效应进行分离提纯、本文以 IgM 得纯化为例介绍此方法。IgM 因分子特别大(900 kd)而不能进入凝胶颗粒得网孔,可首先被洗脱达到初步纯化得目得、
试剂与器材
ﻫ· Sephadex G 100 或 G 200
· 等水腹,清血抗或物养培 bAoM-MgI制粗ﻫ · 洗脱缓冲液:0。01mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8。0 含 0 、5mol /L NaCl
·层ﻫﻫ析柱(1。0 cmÆ ´ 30 cm 或 1.5cmÆ ´ 40 cm)
· 透析袋 (MW CO 10 000) · 器拌搅力磁ﻫﻫ · 器集收分部ﻫ · 紫外检测仪
· 离心机
骤步ﻫﻫ、1,钟分 02 g´0004 心离液清上养培或清血抗、水腹将:理处品样ﻫﻫ以除去细胞碎片、较稠得腹水与血清需适当稀释; 、2,柱析层得适合择选量品样据根:柱装ﻫﻫ将0.01mol/L pH 8、0 含 0 。5mol /L NaCl 得 Tris-HCl 缓冲液加到柱长得 1/4处,然后将漂洗溶涨得 Sephadex G 100 或 G 200 倾入柱中,自然沉降 30分钟, 再用同样得缓冲液平衡柱 1 小时,流速 0.5ml/min;
3、 仪器连接:将紫外检测仪与部分收集器与层析柱连接;
4、 上样与洗脱:待柱上平衡缓冲溶液接近凝胶上表面时,缓慢加入样品溶液 0、5ml/min。当样品液 面接近凝胶上表面时,加少量缓冲液清洗柱壁,然后接上缓冲液洗脱并收集 1-2 ml/管。280nm 检测得第一蛋白峰即为 IgM-MoAb。、5测检mn082将:存保与缩浓ﻫﻫ得第一蛋白峰合并,移入透析袋在磁力搅拌器上 4°C 对 PBS 流动透析过夜。透析后得溶液可经聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥浓缩后,分装封管,-20°C 保存备用。
ﻫ
测检ﻫﻫ1、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法(RIA、ELISA)检测各部分洗脱液得抗体。
2、IgM-MoAb 一般在外水体积洗脱。
ﻫ
示提用应ﻫ1、凝胶过滤不变换洗脱液,一次装柱后可反复使用多次。操作简单,快速经济。
、2可,活失性变品样物生起引易不,与温法方且,%001 达可乎几收回品样,高性复重可验实ﻫ进行大量样品得分离纯化。
、3品样于大应积体柱,柱析层得离分)000 02>WM(物子分大从)盐机无如(物子分小于用ﻫ体积 4-10 倍,其高与直径得比例应为 5:1-15:1;用于大分子物之间得分离(如免疫球蛋白之间得分离),则柱体积应大于样品体积 25—100 倍,高与直径得比例应为 20:1—100:1。
4、Sephadex凝胶装柱时,应灌制均匀无断层与气泡、在整个操作过程中,凝胶应始终保持在液面以下。
ﻫ5、提取得 IgM 浓度过低或反复冻融会引起变性,应分装后在-70°C或-20°C 冻存,或者加 0.2g/L叠氮钠在 4°C 可保存数月。
6、如无合用得部分收集器,可手工收集1-2ml/管,用分光光度计测定各管吸光度值。
参考文献
1、 周本正编着 《层析技术及其应用》 湖北科学技术出版社(1992)28-30
、2子分《 译等然安吴,学昌郑 编主 姆洛索勃阿.R.D ,斯奥范。J。C ,西塔阿、Z。Mﻫ免疫学》 科学出版社 (1988) 212-214
ﻫ
第六节 免疫球蛋白 G 得亲与层析纯化法(蛋白 A 或蛋白 G 法)
理原本基ﻫ球链组 G 是就 G 白蛋。分成)llaw llec()llaw llec(壁胞细得菌球萄葡色黄金是就 A 白蛋ﻫ菌得细胞壁(cell wall)(cell wall)成分。这两种蛋白质分子可通过免疫球蛋白得 FC区与大多数哺乳动物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)得 IgG 结合(见表1)、利用基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)技术,将蛋白 A 与蛋白G分子中与Fc 区结合得结构域部分得基因融合,所产生得融合蛋白,则具有更广泛得 IgG 结合特异性。蛋白 A、蛋白 G 或融合蛋白 A/G与免疫球蛋白Fc 段得结合性能使它成为可用于IgG分离得、天然得亲与配基。将这些配基蛋白结合到固体支持物上,提供了应用亲与层析纯化抗体得一步法得基础。
试剂及仪器
ﻫl 含 IgG得样品 ﻫl PBS(见附录)
l 装有 2ml 固相化得蛋白A、蛋白 G 或蛋白 A/G 得小型层析柱(有商品供应) ﻫl 透析袋(MWCO 10,000) ﻫl 结合缓冲液:0。1mol/L Tris-HCl pH7、5 + 0。15mol/L NaCl可(器集收步分 lﻫﻫ按需要选用)
l 洗脱缓冲液:0、1mol/L Gly-HCl pH2。8+0。15mol/L NaCl
0。8 Hp lCH-sirT L/lom1:液冲缓与中 lﻫ l 蠕动泵(可按需要选用) ﻫ 器测监VU lﻫl pH计
操作步骤
* 样品(可为血清、腹水、含有 IgG得单克隆与多克隆抗体得细胞上清液)。
.1在品样ﻫﻫ4℃,对结合缓冲液透析过夜,或将其与至少 1:1 稀释得结合缓冲液混合;
2。
如果条件充许,将层析柱与蠕动泵、分步收集器与 UV监测器相连;
、3 ;质介析层与亲 lm2 得中柱涤洗 ,度速nim/lm1 以 ,液冲缓合结 lm01用少至ﻫ 、4ﻫ ;样上ﻫ5. 一旦样品进入凝胶,用结合缓冲液洗柱(至少 10 个柱体积),直至 A280nm 小于 0、03; .6ﻫ ;管/lm2集收布分,GgI 得合结所脱洗液冲缓脱洗用ﻫﻫ7. 收集过程中,每管立即加入 0.1ml 中与缓冲液,以中与洗脱所得得 IgG 液。
、8,)钠氮叠 L/g020、0(剂腐防入加,性定稳得体抗据根后其,析透SBP 对管各得 GgI含ﻫ置 4℃或冷冻保存。
实验要点及说明
ﻫ通常可通过 SDS-PAGE 分析或通过适当得免疫方法 (如 Western blot, ELISA 等),对洗脱组分进行纯度鉴定与免疫活性测定、 、1容得白蛋球疫免定特对得柱析层由量样上ﻫﻫ
量确定,2ml柱对于小鼠 IgG 得容量约 10mg,对于人 IgG得容量约为 18mg; ﻫ2。
柱上结合得抗体被洗脱得速度很快, 通常在第一洗脱流份中; ﻫ3. 下列缓冲液也可用为结合缓冲液:含0.15mol/L NaCl得 50mmol/L硼酸钠 pH8、0,或含 0、15mol/L NaCl得 0。1 mol/L 磷酸盐液 pH7.5。
高盐结合缓冲液(>1 mol/L NaCl)可能增加总得柱结合容量约 50%; ﻫ4、 应用 pH8。0—9、5 得缓冲液作为结合缓冲液,通常能增加蛋白 A 对小鼠 IgG 得结合力; .5CaN L/lom 51.0含 0。5Hp 如,液冲缓合结得 Hp 低用可,柱析层得 G 白蛋于对ﻫﻫl得 50mmol/L 醋酸缓冲液;
.6irTL/lom1。0 得 lCaN L/lom2、0含:如 ,液脱洗得与温较比用需,体抗得感敏Hp 对ﻫs-醋酸 pH7、7或 3mol/L KCl 或 5。0mol/L KI 或 3。5mol/L MgCl2;
7、 蛋白G也能与 IgG得 CH1 区结合,所以不能用于 F(ab’)2 与 Fc 得分离;
8. 如果无蠕动泵与部分收集器可用,也可利用重力进行上样及洗脱,手动收集 2ml / 管,用分光光度计测定 280nm 得吸光度。
参考文献
1、 Bjorck,L, And Kronvall,G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG binding reagent、 J、 Immunol、 133,969—974 ﻫ2。
Eliasson,M.,Olsson,A.,Palmcramtz,E.,Wiberg,k、,Inganas,M、,Guss,B、,Lindberg,M。, and Ulldh,M、(1988)Chimeric IgG-binding receptor engineered from staphylococcal protin A and streptococcal protein G、J。Biol、Chem。263,4323—4327.
(张文利、朱正美)ﻫ
法方得 2)’ba (F备制 GgI 从解酶用应 节七第ﻫﻫ基本原理
疫免在均酶种两这。法方得 2)’ba (F备制 GgI 从酶白蛋萝菠及酶白蛋胃用应绍介文本ﻫ球蛋白得绞链区双硫键得下方分解IgG(见图 1),裂解产物为三个片段,即两个相同得 Fab 段与一个 Fc 段,Fab 段即抗原结合片段,含有一条完整得轻链与半条重链,分子量约 50000。首选得酶就是胃蛋白酶,它在 IgG 得绞链区二硫键得近 C 末端切断重链,生成大、小两个片段,大片段为Fab 双体,称为 F( ab") 2,其功能与 Fab 相同。胃蛋白酶可用于大多数得小鼠得IgG1 及IgG2a 以及大鼠、人与兔得 IgG抗体制备 F( ab’)2,但不能用于小鼠得 IgG2b抗体、应用本法,可通过 HPLC 测定组分得大小来判定水解得程度、F( ab’) 2组分在分子量100000部分洗脱,而 IgG则在分子量150000得流分中、 过经或,酶白蛋萝菠用采可此因,段肽得小较为解水酶使或,酶白蛋胃抗体抗 1GgI 鼠小于由ﻫ预试来选择确定合适得蛋白酶、 ﻫ
图意示位部解水酶白蛋同不GgI 1-7—2 图ﻫ试剂及仪器
ﻫl 0、2mol/L TE8: 0。2mol/L Tris-HCl pH8。0 + 10mmol/L EDTA,按要求稀释到 20mmol/L TE8 ﻫl 2mol/L 醋酸, pH3.7: 103ml 冰醋酸 + 17、2 克醋酸钠用蒸馏水配至 1L07 lﻫﻫmmol/L 醋酸/ NaCl ,pH4.0:70m mol/L ,50m mol/L ,pH4、0 (22ml 冰醋酸, 1。
15 克醋酸钠,2。29 克NaCl,用蒸馏水配至 1L
配现用现,0、4Hp 液 lCaN /酸醋 L/lom m07 于溶酶白蛋胃 lm/gm01:酶白蛋胃 lﻫ l 1 mol/L Tris pH9、2 (121 克 Tris碱溶于 1L蒸馏水,以 HCl 调至 pH9.2)
l 50m mol/L TE7:50m mol/L Tris-HCl pH7.0 + 2 mol/L EDTA
l 2—巯基乙醇 液胺酰乙碘 L / lomm 05 :液存储胺酰乙碘 lﻫﻫ l 50m mol/L TE7 碘乙酰胺应用液:(加 1%体积得碘乙酰胺储存液到50m mol/L TE7中,现用现配—2 入加、制配前解水临在,液 7ET L/lom m05得 lm/gm01:酶白蛋萝菠 lﻫﻫ巯基乙醇至终浓度为0、5μmol/L ,在 37℃保温 15 分钟,以使酶活化
CLPH 析层阻排子分得 000052-00001 围范级分 lﻫﻫ置装缩浓得膜滤 OCWM 000,01 lﻫ系统 8 高床胶凝、mc5。2 径直根两用可。柱)阻排子分(滤过胶凝得质白蛋 000051 离分可 lﻫ0cm 得柱子***,以30ml/小时得流速,来分离 10-100mg 得IgG ﻫ 浴水 lﻫl 透析带(10000 MWCO)、用前在含 0、1mmol/L EDTA 得蒸馏水中煮沸、清洗
骤步作操ﻫ(ﻫ 量用得品样 GgI解酶 )一ﻫ通常酶解50-200mg IgG ,可生成20-100mg F(ab’)2。对于新抗体,可先用5-15 mg 试做,以确定所用酶对抗体得水解能力; ( 理处予及度浓得 GgI)二ﻫ 将 IgG 浓缩到 10—15 mg/ml ,为进行胃蛋白酶水解,IgG 要先对 0.02 mol/L TE8 透析,为进行菠萝蛋白酶水解,IgG要先对50mmol/LTE7 透析;(解水酶白蛋胃 )三ﻫﻫ法 ﻫ1。
用 2 mol/L 醋酸(pH 3。7)将抗体液得 pH 调到 4。0-4、2,将胃蛋白酶终浓度稀释到 30g/L(W/W); ﻫ2。
在37℃水浴中保温酶解、每次取样10μl 通过 HPLC 测定水解组分得分子大小。在水解过程中,HPLC测定得洗脱峰应从 IgG 得单峰变成两个峰,分子量小得组分就是 F(ab") 2。水解通常需要 6—12小时;
3. 当水解到IgG 浓度〈100g/L, 或 F(ab’) 2峰得大小不再增加时,加入 1 mol/L Tris (pH 9。0),调节反应液到 pH 8.0,以终止反应、
ﻫ(四)菠萝蛋白酶水解法 .1。度浓得要需到达,液酶白蛋萝菠得化活已入加中液溶体抗向ﻫﻫ对不同抗体,所需得酶浓度要先用预实验来确定,一般得酶浓度在5-40g/L (W/W)之间; ﻫ2. 反应过程中,同胃蛋白酶水解法一样,用 HPLC来监测水解得程度;
3、 当水解到 IgG 浓度<100g/L ,或 F(ab’)峰得大小不再增加时,加入碘乙酸至终浓度 0。5m mol/L ,终止反应、
(ﻫ
离分得 2 )’ba(F 物产)五ﻫ1. 用经过 0、2 mol/L TE8 平衡得凝胶过滤柱,按分子量大小来分离水解组分; .2分ﻫﻫ离后,将分子量 100000 得 F(ab’) 2 峰合并、浓缩。
ﻫ
图 2-7—2 产物 F(ab’) 2 与 IgG 得分离
明说及点要验实ﻫﻫ .1,升上Hp,加增显明会性活其降下Hp,外围范Hp适最在,感敏度高Hp对性活得酶白蛋胃ﻫ其活性则会明显下降;
2.大多数得 IgG1得水解需 6—12 小时、也可将水解液置4℃水解过夜。小鼠 IgG3 很难被酶解消化成 F(ab") 2;
。3吸疫免 γcF -抗过通需还物产解水,时 2 )’ba(F 得段 cF或 GgI含不全完要需当ﻫ附柱纯化(请参阅参考文献 1),或通过蛋白 A-琼脂糖柱纯化;
4. 水解得程度也可通过非还原性得 7。5%SDS-PAGE与考马氏蓝染色来测定。
文考参ﻫﻫ献
.1 noitaraperP )3991( 、J ,namneerG dnA .LA ,ttuT ,、JM ,einnelGﻫﻫof multispecific F(ab’)2 and F(ab")3 antibody derivatives、 In Tumor Immuology. A Pratical Approch (eds。
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(1983) Preparation of F(ab")2 fragmentsorFﻫﻫm mouse IgG of various subclasses。
J。
Immunol。
Meth、 56, 235—243、 (ﻫ )美正朱ﻫ第八节 从 F(ab’)2 制备 Fab’
理原本基ﻫ 在 F(ab’)2绞链区得双硫键可用巯基乙醇使之还原,得到具有游离 SH 基得Fab’,随后可用碘乙酸使 Fab得游离 SH 基烷基化,从而防止其再氧化生成 F(ab’)2。
备设与剂试ﻫﻫ l 0。2 mol/L TE8: 0.2 mol/L Tris-HCl, pH 8.0 + 10m mol/L EDTA ﻫl 2—ME 还原溶液:220mmol/L 2-巯基乙醇+1mmol/L EDTA (在通风橱中配置此溶液 ) ﻫl 250mmol/L 碘乙酸: 250mmol/L 碘乙酸储存液同(柱滤过胶凝及统系 CLPH lﻫﻫ前)
骤步作操ﻫﻫ 洗冲及沸煮中水ATDE L/lomm1、0 含在过经。袋析透 lﻫ。1)"ba(Fﻫﻫ2得浓缩:将所得得F(ab’)2 液浓缩到 0。5-15mg/ml 范围;
2。
还原: )1(2为度浓终(液原还醇乙基巯—2 得积体 01/1入加中液 2)’ba(F向ﻫﻫ0m mol/L 2—巯基乙醇);
(2) 在 25℃水浴中保温 30 分钟;
)3( ;基HS 得离游闭封以,酸乙碘 L/lom m052 得积体 01/1 入加ﻫ )4( ;钟分01 温保中浴水℃52 在ﻫ)5(生原还与液原 2)’ba(F 较比过通,法析分 CLPH 用ﻫﻫ成得 Fab’得量,来检测还原度。Fab’在 F(ab")2 之后被洗脱,使得洗脱得峰形改变(见图 1)。Fab’得分子量为50000;
(6) 在大多数得情况下,大于 950g/L得 F(ab’)2 被还原为 Fab’。
、3 :离分得物产’baFﻫﻫ )1(基巯-2 得余残,得要需验实合符是就,2)’ba(F 得原还未得量少在存仅中液备制在果如ﻫ乙醇与碘乙酸可通过对缓冲液透析以除去; ﻫ
(2) 如果还原不够充分,或需要Fab’完全与未还原得 F(ab’)2 分离,则可在 0、2 mol/L TE8 液中通过凝胶过滤法进行分离,合并、浓缩分子量为 50000得 Fab’峰。
)042 图(离分得 2)’ba(F 与物产’baF 4-7—2图ﻫﻫ
明说及点要验实ﻫ1、 上述操作也会使 IgG 得部分重链双硫键还原,但因非共价相互作用还可维持重链与轻链得连系,故不影响 Fab 段与重链得结合性能。然而,在非还原性 SDS—PAGE 分析图谱中,则可瞧到完整得 Fab"(分子量大约50000Da)及轻链(大约25000Da)两条条带;
2. 可用100g/L 得非还原性 SDS—PAGE,来检测反应液中 F(ab’)2 得还原程度。F(ab’)2条带约分子量 100000Da,Fab’在 50000 Da,而已还原得重链及轻链分子量为 25000 Da ,条带容易分辨。
ﻫ参考读物
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J、 Immunol。
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化纯 A 白蛋球疫免 节九第ﻫ 基本原理
聚或体单以 AgI 中血。等结巴淋,髓骨,膜粘如,生产官器与织组种多由可)AgI(A 白蛋球疫免ﻫ合体形式存在,含量约为210± 80mg,骨髓瘤病人血清中IgA 水平增加。
IgA 分IgA1 与IgA2两种亚型,其中IgA1亚型占总IgA得90%以上,并在铰链区结合有特征性得O—连接寡糖链、(见第六篇,第二章)。实验中常需对总 IgA 及 IgA1 亚型进行分离、纯化与鉴定。IgA 纯品价格昂贵,如能自己制备,则可节省资金。
一、IgA得抗体亲与层析分离
ﻫ原理
ﻫ利用IgA 抗体对IgA 抗原得特异结合特性、溴化氰活化得 Sepharose-4B 凝胶与多克隆抗IgA抗体,或抗IgA1亚型单抗共价交联制备亲与层析柱。经亲与柱分离,即可得到总IgA或 IgA1 亚型纯品。
ﻫ试剂与仪器
ﻫl 多克隆抗 IgA 抗体,或抗 IgA1 亚型单抗 ﻫl 抗体—Sepharose—4B 偶联胶:制备过程参见(第二篇,第一章),或购买成品胶、0 lﻫﻫ22µM 微孔滤膜 0。8 Hp,钠酸硼 L/lom10、0 lﻫﻫ柱析层 lﻫﻫ 7.2 Hp,液冲缓酸盐-酸氨甘 L/lom52。0 lﻫ l Tris—HCl 缓冲液,pH 8.0
液冲缓SBP lﻫ光光分外紫 lﻫﻫ管试 lﻫﻫ0。8 Hp,钠酸硼 L/lom10、0 得 3NaN %20.0 含:液存保 lﻫ度仪
l 离心机
骤步作操ﻫ
1。
收集5ml 血清,27,000g,4℃离心 30min。上清经0、22µM微孔滤膜过滤,-20℃保存,或直接应用、
2、 20ml 交联好得抗体—Sepharose-4B偶联胶装柱,并用 0、01mol/L 硼酸钠缓冲液(pH 8、0)平衡柱子,约 5-10 个柱体积。
.3 。样上ﻫ、4。lm1 集收管每 ,nim/lm1~5、0为速流,柱洗液冲缓钠酸硼述上用ﻫﻫ测定各管得 A280 吸光值,直至 A280 吸光值为零。
.5中管各于,lm1 管每,液出流集收,脱洗)7.2 Hp(液冲缓酸盐-酸氨甘 L/lom52。0 用ﻫ即刻加入 200ul Tris-HCl 缓冲液(pH 8。0)。
ﻫ6。
合并各管,并用 PBS 4℃透析,过夜。
。7 。子柱衡平)0.8 Hp(钠酸硼 L/lom10。0 得积体柱倍 03~02 用ﻫ。8柱倍01 用ﻫﻫ体积得保存液洗涤柱子,并于 2~4℃保存。
点要术技ﻫﻫ 、1 、度纯得品样离分 AgI定鉴法方泳电 EGAP—SDS 用采ﻫ.2,低量含得 AgI 中清血ﻫﻫ因此上样前最好将血清经硫酸铵沉淀处理、 、3caJ、二ﻫﻫ 。泡气有没内柱析层保确ﻫﻫalin 亲与层析柱分离纯化 IgA1 ﻫ
理原ﻫﻫ利用凝集素 Jacalin 对 IgA1 得糖链末端特异结合得特性,经 Jacalin 亲与层析柱分离,制备IgA1 亚型纯品。
试剂与仪器
l 葡聚糖凝胶G-25
柱析层 nilacaJ lﻫﻫ剂试氏纳 lﻫﻫ7 Hp , lCH—sirT L/lom571、0 lﻫ l Ca2+-TBS 缓冲液:含1mmol/L CaCl2ﻫ SBP lﻫﻫl 半乳糖—Ca2+—TBS 缓冲液:含 0、8mol/L 半乳糖 液溶 lCaN L/lom2.1 lﻫﻫ l 保存缓冲液:含 0.05nmol/L CaCl2 与0。15mol/L NaCl 得0。01mol/L PBS 缓冲液
l 层析柱(内径 1、1X长度12cm)
l 尼龙布
l 白瓷凹板
l 试管
管胶 lﻫ l 紫外分光光度仪
机心离 lﻫﻫ 操作步骤 ( 理处得品样清血)一ﻫﻫ。1 淀沉胺酸硫过得清血ﻫ5 )13置静,拌搅边加边 ,胺酸硫过 g8。2 入加慢缓,lm5 液冲缓 SBP得积体等加清血 lmﻫ0 分钟。
0003 )2 。钟分 01 心离钟分/转ﻫ )3 。样上待 ,中液冲缓得)5、7 Hp( lCH-sirT L/lom571.0 于悬重淀沉ﻫ 2.脱盐
ﻫ1) 装柱:称取葡聚糖凝胶G—25 1g, 加蒸馏水50ml,微火煮沸1小时(注意随时补充蒸馏水以免蒸干)、静置冷却后倾弃上清液,加入 10ml PBS,并轻轻搅拌,将凝胶倾入层析柱内、用PBS 洗 5~10 个柱体积当液面恰好与凝胶面重合时,立即拧紧夹子,准备上样。
)2:盐脱ﻫﻫ将步骤1处理后得血清样品上样。待样品全部流入凝胶内时,再沿管壁加入少量 PBS 冲洗。
3) 收集样品:流速为8—10 滴/分,每管 1ml,连续用 PBS洗涤至用纳氏试剂检测无 NH4+为止、
)4ﻫ 。用备管值峰并合,值光吸082A 得管品样各测检ﻫ(二)过柱
.1 。中柱析层到加)lm2约(胶凝 nilacaJ 将ﻫ 2、 用 Ca2+—TBS 缓冲液洗柱,约 10 倍柱体积。
3、 上样。
、4 。下以 nim/lm5.0 在制控速流,柱洗液冲缓 SBT—+2aC 用ﻫﻫ 5、 收集流出液,重复上样三次。
6。
用 Ca2+—TBS 缓冲液洗柱,收集流出液,每管 0.5ml。测定各管 A280 吸光值,洗脱至吸光值低于 0、03。
ﻫ7. 用半乳糖—Ca2+-TBS 缓冲液洗脱,收集洗脱液,每管0、5ml。测定各管 A280 吸光值。
ﻫ8。
合并各管液体,用 PBS 在 4℃透析样品、
9。
用 10 倍柱体积得 1、2mol/L NaCl 洗柱。
、01衡平液冲缓存保得积体柱倍 05用ﻫﻫ柱子。
.11保℃4~2 于并,子柱涤洗液冲缓存保得 3NaN %20.0 含得积体柱倍01 用ﻫ存、
ﻫ技术要点 .1 、度纯得品样离分 1AgI 定鉴法方泳电 EGAP-SDS 用采ﻫﻫ、2.。量合结得1AgI 加增可,夜过℃4于放柱将后样上或,样上复重ﻫ3度过要不后样上ﻫﻫ洗涤柱子,以免损失 IgA1。