[摘要] 目的 探讨纤支镜毛刷细胞块技术的应用方法和价值。 方法 对32例纤支镜毛刷常规涂片后再将剩余细胞用10%中性福尔马林固定制成细胞蜡块(cell block,CB),先行常规HE染色,再根据需要选择酶标行免疫组化。 结果 CB常规HE染色细胞清晰,有一定的组织学结构,有利于明确诊断;免疫组化则阳性定位准确,着色清晰,对肿瘤分型效果较好。两种染色方法染色效果均好于常规涂片,差异有显著统计学意义(P < 0.01),与肺活检及术后组织切片差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 用10%中性福尔马林固定的纤支镜毛刷CB的制作方法简便、经济、染色效果好,在诊断肺疾病、特别是肺肿瘤中有较高的实用价值和广阔的应用前景,值得推广。
[关键词] 纤支镜毛刷;细胞块;常规HE染色;免疫组化;10%中性福尔马林
[中图分类号] R446.6;R361.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2013)36-075-03
The application methods and value of fiber lens brush cell block technique
ZHANG Guizhen ZHU Zhenda CHEN Cheng
Department of Pathology, Yuhang District Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou City in Zhejiang Province, Hangzhou 311106, China
[Abstract] Objective To study the application methods and value of fiber lens brush cell block technique. Methods For 32 cases of fiber lens brush after conventional smear in the remaining cells again fixed with 10% formaldehyde wax block made from cells (cell block, CB), the first routine HE staining, again to choose according to the need to enzyme immunohistochemical marking line. Results CB routine HE staining cells clear, histologic structure to a certain extent, was conducive to clear diagnosis; Immunohistochemical positive for accurate positioning, color clear, has good effect for tumor classification. Two dyeing methods were better than regular smear dyeing effect, so the significant difference of statistically was significant (P < 0.01), and the lung biopsy and postoperative biopsy difference was not significant (P > 0.05). Conclusion The production method of the fiber lens brush CB fixed with 10% of formaldehyde is simple, economic and The dyeing effect is good, in the diagnosis of pulmonary diseases, especially lung cancer has a high practical value and broad application prospect, the production method is worth promoting.
[Key words] Fiber lens brush; Cell block; Routine HE staining; Immunohistochemical; 10% formaldehyde
纤支镜毛刷细胞学检查是诊断肺疾病、特别是肺肿瘤的重要手段之一,已被广泛用于临床,当纤支镜活检和经皮肺穿刺活检由于多种因素被迫放弃,此时的纤支镜毛刷细胞学检查是术前最佳的病理检查方法,显得尤为重要,并对已不适合手术治疗的老弱患者和晚期癌症患者来说也是较佳的病理检查方法。笔者对32例纤支镜毛刷常规涂片后再将剩余细胞制成细胞蜡块(cell block,CB),先行常规HE染色镜下观察,再根据需要选择酶标行免疫组化(如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等),两者结合观察,对肺疾病进行病理诊断,特别是对肺肿瘤进行组织学上的分型,效果较好,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 实验材料
50 mL尖底塑料试管1支,直立平衡离心机1台,盛10 mL 10%中性福尔马林的小瓶1只,老虎钳1把,震荡器1台。
1.2 方法
1.2.1 毛刷处理 毛刷刷取细胞后快速涂片2张,95%乙醇迅速固定,常规HE染色。涂片后马上用老虎钳剪断毛刷放入盛有10 mL的10%中性福尔马林的瓶内固定。
1.2.2 制片方法 毛刷在10%中性福尔马林液固定1 h后用干净的镊子取出,用针尖挑(或刮)出刷内物,尽量挑干净,再把毛刷在固定液内漂洗,而后把固定液倒入试管内。再重新倒入10 mL左右的10%中性福尔马林在瓶内,在震荡器上震下刷内残余的细胞,再把这10 mL的中性福尔马林倒入同试管内,再加一定的量,使试管内的福尔马林总量达30~40 mL,离心3000 r/min、15 min,取出放在试管架上固定2~4 h左右,如标本上午送来的则当天即可与常规组织同脱水,如下午两三点后送来则固定过夜。固定好后倒去固定液,此时沉淀物已结块,小心取出,放在滤纸上滴入伊红包好,与常规组织同时进行脱水、包埋予0.4 mm厚连续切片8张左右,其中1张常规HE染色镜下观察,再根据需要选择酶标行免疫组化。
1.2.3 染色合格标准 将常规HE合格标准定为:细胞清晰,核浆对比分明,组织学结构可有(或无),有利于明确诊断。将免疫组化合格标准定为:阳性定位准确,着色清晰,有助于肿瘤的分型。
1.2.4 免疫组化方法 CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、 34βE12、TTF-1等单克隆抗体购于北京中杉公司,实验流程采用EnVision二步法。
1.2.5 统计学处理 采用SPSS16.0统计学软件处理。用Kolmegorov-Smirnov方法进行正态性检验,使用χ2检验对正态分布的构成比进行比较,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
40例肺纤支镜毛刷,先直接常规涂片,再将剩余细胞用10%中性福尔马林固定制成细胞蜡块(CB),除8例由于细胞数量过少或血过多等原因使CB制作失败外,成功的32例常规HE染色效果较好,细胞较清晰,有一定的组织结构;免疫组化则阳性定位准确、着色较清晰,与常规涂片相比差异有统计学意义(P < 0.01)、与肺活检(或术后组织切片)相比差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1。
表1 三种不同方法检测结果比较[n(%)]
图1、2 CB中的片状异型鳞状上皮组织,HE,×10与×40
图3 CB中的正常腺管状结构,HE,×40
图4 CB中的支气管黏膜,×10
图5 活检中的支气管黏膜,×10
图6 术后常规切片对照,HE,×40
图7 直接常规涂片对照,HE,×40
图8 34βE12在CB中的(与图1同片)阳性表达,Envision法,×10
图9 34βE12在直接常规涂片中的阳性表达,Envision法,×10
图10 34βE12在术后常规切片中的阳性表达,Envision法,×10
图11 CB中的片状鳞状上皮(右下)与坏死组织(左上)分界清,×10
图12 术后切片中的鳞状上皮(上)与坏死组织(下)分界清,×10
3 讨论
3.1 纤支镜毛刷细胞块的HE染色效果
本方法制作的CB在HE染色上与文献报道[1]的相似:细胞境界、核膜、核染质、核仁清楚;也有一定的巢状、片状、管状结构组织学结构和排列方式[2](图1、2、3、4),等同活检(图5)和术后切片(图6)的图像,两者染色效果对比差异无统计学意义(P > 0.05)。而直接常规涂片最大的缺陷是细胞量少,很难看到组织学结构[3],我们观察的病例大多似此,且常伴有细胞退变(图7),常与坏死物、血细胞混合,干扰细胞的分辨,给诊断带来一定的困难,两者染色效果对比差异有统计学意义(P < 0.01)。
3.2 纤支镜毛刷细胞块的免疫组化效果
本方法制作的CB在免疫组化上阳性定位准确,着色清晰,背景也清晰无干扰(图8),与活检和术后切片(图10)相似,两者染色效果对比差异无统计学意义(P > 0.05)。而常规涂片免疫组化出现高背景染色,细胞集群呈三维结构,尤其是膜着色的更难判断[4],着色有模糊朦胧(图9)的感觉,给判断带来一定的困难,两者染色效果对比差异有统计学意义(P < 0.01)。
3.3 纤支镜毛刷细胞块的制作体会
纤支镜毛刷常规涂片后再把毛刷内残留的物质挑(或刮)出再离心制成细胞块,优良的纤支镜毛刷技术和小心、耐心挑(或刮)出刷内残留物使有足够量的肿瘤细胞是成功制成CB的主要环节。毛刷内物固定1 h左右后有一定硬度,易于挑(或刮)出,刷内物直接挑(或刮)出,对成小片状、小粒状刷下组织的破坏较小,很好地保存了原有的组织学结构(图4),再利用离心机的离心力把漂下、震下的分散细胞经过高度浓缩压紧,也一定程度地显示了组织学模式,并能显示涂片中不能显示的特征性组织结构,如鳞癌的角化珠、乳头状结构、肿瘤的组织间质等[5],又如我们观察到的片状上皮成分与坏死组织分界清(图11)及较完整的黏膜结构(图4)的图像,与活检(图5)和术后切片(图6、图12)极其相似,且又不浪费所刷取的任何材料。而直接常规涂片最大的缺陷是材料浪费,细胞量少,又很难看到组织学结构。现虽有较先进的液基细胞学技术,但经过振荡,标本中组织学结构大部分被离散,涂片中也很难看到组织学结构,又经过膜式过滤后,细胞量也相应减少,对刷取的材料仍有浪费。
我们不用95%乙醇固定,用10%中性福尔马林固定,是因为高浓度的乙醇可使组织细胞收缩和变脆,难以切片外,还可溶解红细胞中的血红蛋白[6],在免疫组化染色时会干扰背景加重背景着色。有文献报道脱落细胞有完整的细胞膜,虽经乙醇固定,其包膜上的类脂质不能充分溶解,影响试剂的渗透造成真正的阳性细胞着色不良,影响结果判断[7,8]。10%中性福尔马林对组织渗透作用强,固定均匀、稳定,使组织具有一定的弹性,不仅易于切片外,还能很好地保存组织细胞的形态结构、保存大部分组织细胞内的物质如糖类、无机盐、色素、蛋白抗原等,使抗原定位更加清晰,尤其是对细胞核的抗原固定最佳[9],利于进行免疫组化染色和分子生物学检验。我们制作和观察的病例大多有类似的结果,免疫组化效果较佳(图10)。但福尔马林渗透速度较乙醇慢,所以固定时间较长,一般要2~4 h[10],如果急需加快,也可采用付海洋等[9]介绍的方法:在前固定的基础上再利用超声波进行后固定,加速福尔马林对细胞的渗透和固定。另有文献报道常规涂片免疫组化细胞成分复杂,除有较强的非特异性背景着色外,三维细胞团免疫试剂容易进入产生假阳性[11];CB免疫组化染色则背景干净,几乎没有假阳性[12]。
3.4 纤支镜毛刷细胞块的应用前景
细胞块作为细胞学诊断中重要的辅助手段最初应用于胸腹水、心包积液等液体标本,在国外该技术已经成为脱落细胞学的常规操作技术,并已应用很久,目前国外普遍采用自动化制作细胞蜡块,但该方法设备成本较高且技术较为复杂[13]。传统的细胞块制作方法有琼脂或生物胶水包埋法、固定沉降法、血浆凝血酶凝集法、鸡蛋清凝集法和医用脱脂棉吸附法,不仅操作复杂,且通透性较差,影响脱水、透明和浸蜡,造成制片困难和染色效果差[14,15]。我们制作的方法较为简便,只需1台离心机用10%中性福尔马林固定,2~3 d即可完成常规HE染色和免疫组化染色,并因未用任何媒介物,干扰图像较少,染色效果较佳,更易于镜下观察。CB还有优点是可以连续切片,用于多种酶标检测,如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等诊断肺肿瘤的酶标均可用上,以满足诊断需要。并可长期保存,其成本对实验而言也是最经济的。已有文献报道CB用于原位杂交检测定位准[16],因条件限制,我们尚未开展,但是我们以后努力的方向。所以用10%中性福尔马林固定的纤支镜毛刷CB方法简便、经济、效果好,在诊断肺疾病、特别是肺肿瘤中有广阔的应用前景,值得推广。
[参考文献]
[1] 陈建华,陈中,丁博. 血浆凝固法胸腹水细胞块技术的临床应用[J]. 实验与检验医学,2012,30(4):412-413.
[2] 窦燕,邓节喜,张闽峰,等. 恶性心包积液细胞块病理检查的意义(附30例分析)[J]. 现代肿瘤医学,2011,19(9):1748-1749.
[3] 舒仪经,阚秀. 细针吸取细胞病理学[M]. 北京:人民卫生出版社,2000:5.
[4] 罗巧明,江鹤灵,张建. 免疫细胞化学染色检查协助鉴别浆膜腔积液中转移性腺癌原发部位[J]. 现代肿瘤医学,2012,4(20):822-823.
[5] 邱瑞成,唐世洪,杨天真. 超声波快速石蜡细胞块切片技术在细针穿刺活检中的应用[J]. 临床与实验病理学杂志,2004,20(4):487-488.
[6] 王德田,董建强. 实用现代病理学技术[M]. 北京:中国协和医科大学出版社,2012:324.
[7] 祝佳,朱涛. 细胞块石蜡切片在脱落细胞学中的应用[J]. 浙江临床医学,2006,8(10):1100.
[8] Patricia AF,Aylin S,Keith B,et al. Comparison of three conllnonl used cytologic preparations in effusion immunocytochemistry[J]. Diagn Cytopathol,2002,26:61.
[9] 付海洋,王成勤,赵洁. 快速石蜡法在胸腹水细胞蜡块制作中应用[J]. 临床与实验病理学杂志,2012,28(7):820-821.
[10] 贾世军,覃胜,杨霞,等. 乙醇凝固鄄甲醛固定法细胞块技术在头颈部肿瘤针吸检查中的诊断价值[J]. 临床与实验病理学杂志,2012, 28(9):1053-1054.
[11] 潘黎明,张谷. 乳腺癌细针吸取细胞蜡块检测ER、PR、C-erbB-2[J]. 现代中西医结合杂志,2007,16(18):2564-2565.
[12] 苏学英,陈志强. 细针穿刺诊断中应用细胞块的价值分析[J]. 中华病理学杂志,2003,32(1):55-56.
[13] 马纪周,李娜,陬俊. 蛋清液制作胸腹水细胞石蜡制片法[J]. 检验与诊断,2012,8(11):118-119.
[14] 郭宪生. 微小组织琼脂石蜡双重包埋制片法[J]. 临床与实验病理学杂志,1987,3(2):114-115.
[15] 王永生,李玉红,任玉波. 介绍一种新的细胞块制作方法[J]. 临床与实验病理学杂志,2006,22(1):99.
[16] 蒋文化,吴毅林,文一智,等. 细胞块上检测p16、HPV16用于筛查ASCUS中高度宫颈上皮内瘤变的临床探讨[J]. 海南医学,2008, 19(9):15-17.
(收稿日期:2013-07-15)