打开文本图片集
摘要 为了建立运用商品化人类精子无卵黄冷冻液SpermCryoTM Allround冷冻保存食蟹猴精子的方法,比较了快速(-435 ℃/min)、中速(-183 ℃/min)和慢速(-69 ℃/min)的降温速率以及不同冷冻平衡时间(10和30 min)对食蟹猴精子冷冻保存的效果。结果表明,在液氮上方冷冻平衡10 min对食蟹猴精子的复苏活力显著高于30 min。用快速和中速冷冻速率保存的精子的复苏活力较高,冻存精子的复苏活力明显高于慢速冷冻速率保存的精子。该研究建立和优化的SpermCryo无卵黄冷冻液冷冻保存食蟹猴精子的方法,可简单快速完成精子的冷冻保存,并获得较高的冷冻复苏存活率。该研究结果对深入研究灵长类动物精子冷冻损伤的机制和在辅助生殖中的应用具有重要意义。
关键词 食蟹猴精子;SpermCryoTM All-round;冷冻降温速率;冷冻平衡时间
中图分类号 S857.2+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2015)13-148-04
Abstract In order to establish a novel method for sperm cryopreservation of cynomolgus macaque by using the egg yolk free cryoprotective medium SpermCryo Allround, the effects of the holding time (10 and 30 min, respectively) in liquid nitrogen and different cooling rates (-69, -183 and -435 ℃/min, respectively) on sperm cryosurvival of cynomolgus macaques were evaluated. The result showed that sperm cryopreserved for 10 min in liquid nitrogen acheived higher postthaw survival rate than that of 30 min. Sperm cryopreserved at fast and medium cooling rate (-183 and -435 ℃/min) showed higher postthaw survival rate than sperm cryopreserved at slow freezing rate (-69 ℃/min). The optimized cropreserving protocol for cynomolgus macaque sperm by using the egg yolk free medium SpermCryo in our study can achieve preferable cryosurvial rate, and the optimized protocol is easy to use and can save time and labors. Our results will benefit the study for understanding the mechanism of cell injury during cryopreservation and will improve the assistant reproductive technique of nonhuman primate.
Key words Cynomolgus monkeys; SpermCryoTM Allround; Cooling rate; Cooling equilibration time
灵长类动物是生物医学研究中广泛使用的实验动物,由于其在生理生化和遗传上与人类高度接近,因此成为研究人类疾病适宜的动物模型。然而,随着人类对灵长类动物栖息地的破坏,其数量急剧下降。种质资源的低温保存为灵长类动物的迁地保护和生物多样性保护提供了一条有效的途径。目前,灵长类动物的精子冷冻保存的方法大多倾向于经验性,而且难以准确重复。食蟹猴是一类重要的灵长类实验动物,其精子冷冻复苏后往往受到冷冻损伤,复苏后精子活力明显下降,从而导致受精能力下降[1-3]。研究表明,不同类型的冷冻液对食蟹猴精子的冷冻保护作用存在差异,冻存后精子的复苏活力也有明显差异[4]。目前已报道的灵长类动物精子冷冻液中,卵黄作为非渗透性保护剂是主要成分之一,其使用浓度通常为10%~20%[5-6]。通常认为卵黄主要是通过影响精子质膜的相变而起到抗冷休克的左右[7],起主要作用的可能是卵黄中的一类低密度脂蛋白,另外卵黄中的卵磷脂能稳定精子细胞膜,防止顶体破裂,减轻冷冻引起的精子冷休克[8]。但是,由于卵黄的构成成分较为复杂,使深入研究精子冷冻损伤的机制变得十分困难。此外,由于卵黄通常来源于家禽的蛋,可能携带一些潜在的传染性病原体(病毒、细菌、支原体)[9-10],这极大增加了对精子污染的风险,甚至影响精子的受精能力,导致应用冷冻精子开展体外受精和人工授精的成功率下降,并增加疾病傳播的风险。此外,不同来源的卵黄质量参差不齐,其对精子的冷冻保护效果也就存在差异[11-12],难以标准化。因此,建立高效、安全、质量可控的无卵黄冷冻液及相应的冷冻降温程序对于冷冻精子在辅助生殖方面的应用以及精子冷冻损伤机制的研究至关重要。除了冷冻液以外,冷冻降温速率也是影响动物精子冷冻复苏存活率的重要因素之一。每个物种精子冷冻保存的适宜冷冻降温速率与使用的冷冻液种类和冷冻保护剂的浓度有关[13-15]。现有的食蟹猴精子冷冻研究报道使用的降温速率各不相同[3,16],目前还未见到关于研究降温速率对食蟹猴精子冷冻复苏存活率的报道。