摘要:采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法研究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)和三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)5种组织(鳃、外套膜、肠、闭壳肌和斧足)中SOD和EST同工酶的表达情况。结果表明,两种蚌的SOD和EST同工酶均具有明显的组织特异性。SOD、EST酶谱间存在不同程度的种间差异,可作为鉴定池蝶蚌与三角帆蚌的遗传标记。
关键词:池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii);三角帆蚌(Hyriopsis cumingii);同工酶;电泳;组织特异性
中图分类号:S917.4 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2013)15-3615-04
池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)为同属不同种,池蝶蚌原产于日本滋贺县琵琶湖。20世纪90年代,中国从日本引进亲蚌繁殖驯养成功[1]。同工酶酶谱技术在水产领域得到了广泛的应用[2-7]。有关池蝶蚌和三角帆蚌的生物学特性研究已有相关报道[8],而关于同工酶的比较研究少见报道。本研究以池蝶蚌和三角帆蚌的不同组织为材料,对SOD、EST同工酶进行了初步研究,探讨SOD、EST同工酶酶谱表现模式。
1 材料与方法
1.1 材料
池蝶蚌与三角帆蚌均采自常德市东江珍珠养殖场。
1.2 方法
1.2.1 样品的制备 将池碟蚌和三角帆蚌在预冷的解剖盘上迅速进行活体解剖,剖取外套膜、闭壳肌、斧足、鳃和肠5种组织,用预冷的生理盐水洗两次,在预冷的玻璃研钵中充分匀浆,并加入3~4 mL预冷的生理盐水。把匀浆液用移液枪转入1.5 mL的离心管中在5417C/R型高速冷冻离心机上离心(4 ℃,12 000 r/min,20 min),离心2次以上,取上清液即粗酶液分装于编号的离心管中,置于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳 参照文献[9]进行聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳。采用DYY-III-5型稳压稳流电泳仪,整个电泳过程在 0~4 ℃的环境下进行。用移液枪吸取30 μL粗酶液和25 μL预冷的40%蔗糖溶液,再加入少许的溴酚蓝作为指示剂,每个样品槽中点样30 μL。EST同工酶采用稳压进行电泳,开始时将电压调至250 V,大约50 min后,溴酚蓝指示剂进入分离胶,将电压调至200 V电泳[10],整个电泳过程大约6~8 h。
1.2.3 染色与拍照
1)SOD同工酶。将凝胶板浸泡在2.45×10-3 mol/L NBT溶液中15 min,然后转移到含有0.028 mol/L TEMED、2.8×10-5 mol/L核黄素的0.036 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8)中浸泡5 min,最后将凝胶放在0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8)和1×10-4 mol/L EDTA溶液中光照到显色,并采用Gelpro型凝胶成像系统进行拍摄与分析。
2)EST同工酶。以醋酸萘酯做底物,加入坚牢蓝和 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.4)[11]中,在37 ℃恒温箱中进行染色,直到有清晰的酶带出现,染色时间30 min,并采用Gelpro型凝胶成像系统进行拍摄与分析。
2 结果与分析
2.1 池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶分析结果
池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶电泳结果见图1。在两种蚌的5种组织中分离出3条SOD同工酶带,显示出两种蚌SOD同工酶的丰富多样性和组织特异性,SOD同工酶在两种蚌的不同组织中表达强度不同,在斧足组织中表达最强,鳃、肠中次之,外套膜中最弱。在两种蚌的同一组织中,SOD同工酶的表达也有差别。
池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶表达酶谱见图2。按迁移率的快慢, 以向阳极方向运动最快的酶带编为SOD-1,由阳极向阴极方向依次编号为SOD-2、SOD-3,其中SOD-1在两种蚌的5种组织器官都有出现,活性也相当, SOD-2仅在两种蚌的斧足中出现。以颜色深浅表示酶带强弱,黑色表示强带,白色表示弱带,颜色越深酶活性越强。
根据Gelpro型凝胶成像分析系统分析显示,SOD同工酶在池蝶蚌和三角帆蚌5种组织中的表达情况见表1。从图1、图2和表1可以看出, 在池蝶蚌和三角帆蚌所有被分析的组织中均有SOD同工酶酶带检出,两种蚌的SOD同工酶的表达既呈现出一些相似的特征,又有明显差异。两种蚌的斧足中表达出3条带分别为SOD-1、SOD-2和SOD-3,肠中有2条带分别为SOD-1和SOD-3。池蝶蚌的鳃和闭壳肌中都只有SOD-1表达,而外套膜中有SOD-1和SOD-3表达;三角帆蚌的鳃和闭壳肌中均有SOD-1和SOD-3表达,外套膜中只有SOD-1表达。两种蚌同一组织的SOD同工酶的表达存在差异,表现出明显的种属特异性;同种的不同组织中SOD同工酶的表达也有一定的差异,表现出明显的组织特异性。
2.2 池蝶蚌和三角帆蚌EST同工酶分析结果
池蝶蚌和三角帆蚌EST同工酶电泳结果见图3。在两种蚌的5种组织中共检测到4条EST同工酶带,两种蚌的EST均具有明显的组织特异性, 5种组织间酶谱均有差异,其中在斧足组织中酯酶的带型较复杂,闭壳肌组织中EST的表达量较低。EST同工酶在两种蚌的同一器官组织中的表达也有差异。
按迁移率的快慢,以向阳极方向运动最快的酶带编为EST-1,由阳极向阴极方向依次编号为EST-2,EST-3,EST-4(图4)。其中EST-1在两种蚌的组织器官都有出现, EST-4仅在两种蚌的斧足中出现, 表现出一定的相似性。
根据Gelpro型凝胶成像分析系统分析显示,EST同工酶在两种蚌5种组织中的表达情况见表2。从图3、图4及表2可以看出, 在池蝶蚌和三角帆蚌所有被分析的组织中均有EST同工酶酶带检出。两种蚌的鳃和斧足均有3条酶带表达,闭壳肌和外套膜都只表达了2条酶带,池蝶蚌的肠组织表达了3条酶带而三角帆蚌只表达了2条酶带。酶带的亮度及宽度说明了组织间的差异以及同种组织中不同EST之间的差异,以此说明其组织特异性。两种蚌的闭壳肌和外套膜都表达了EST-1和EST-2;鳃和斧足均有3条酶带表达,其中鳃的表达基本一致;斧足的3条酶带表达有一定的差异,EST-3只在三角帆蚌中表达,而EST-2只在池蝶蚌中表达。因此,EST同工酶的表达在两种蚌中存在差异,表现出明显的种属特异性;同种蚌不同组织间也存在差异,表现出明显的组织特异性。
3 小结与讨论
3.1 同工酶组织表达特异性的生理意义
SOD和EST在池蝶蚌和三角帆蚌的5种组织中都有分布, 且具有较强的活性,表明这两种酶对蚌类是至关重要的[12]。SOD-2、EST-4只在斧足中表达,而在其他组织中不表达,表现出了其组织特异性。蚌类SOD同工酶的含量较丰富,特别是在斧足中表达出3条酶谱带,与斧足的运动功能是相关的。酯酶性质稳定,环境和反应因素对其影响很小,染色后显带清晰,重复性较好,在不同的生物体内变异较大。因此,常以EST同工酶作为遗传标志用于物种的分类鉴定、种系发生和遗传进化等方面的研究[13]。池蝶蚌和三角帆蚌体内不同组织EST的表达具有明显的差异,显示出明显的组织特异性。
3.2 两种蚌的亲缘关系与种群遗传结构
SOD和EST在池蝶蚌和三角帆蚌中具有较相似的表达活性及同工酶酶谱, 表明这两种蚌具有较近的亲缘关系,与传统分类地位上两种蚌隶属于同一属,亲缘关系较近的结论相吻合。本研究结果为两种蚌之间进行种间杂交提供了科学依据。SOD和EST同工酶在这两种蚌的器官组织中出现多态现象,电泳中的同工酶条带为基因产物的表达形式。在一个群体内个体间某个位点上表现出的条带差异反映了该群体在该位点上的基因型的多态。表明这两种蚌具有可供选择的等位基因,可用于良种选育,国内已经杂交选育出了新型品种——康乐蚌。有研究表明利用同工酶分析可计算养殖动物种群的遗传结构,本研究未能对这两种蚌的种群遗传结构进行分析,有待于进一步研究。同工酶技术能够检测的仅是DNA编码蛋白质的一小部分, 对于揭示蚌类整个基因组的遗传结构来说, 所提供的遗传信息较少。目前, 在蚌的种质鉴定及品种选育方面已应用了随机扩增片断多态性(RAPD)、线粒体DNA的限制性片断长度多态性(RFLP) 和微卫星(SSR) 等分子技术[14],相信随着分子技术的深入开展将对蚌新品种的选育作出更大的贡献。
参考文献:
[1] 徐毛喜.池蝶蚌的引种及繁殖技术[J].南昌大学学报,2000, 24(专辑):21-24.
[2] 朱新平,林礼堂,夏士玲.鲮鱼、麦瑞加拉鲮鱼及露斯塔野鲮酯酶同工酶的电泳研究[J].淡水渔业,1992(5):30-31.
[3] DIAZ-ALMELA E, BOUDRY P, LAUNEY S, et al. Reduced female gene flow in the European flat oyster Ostrea edulis[J]. J Hered,2004,95(6):510-516.
[4] 徐 成,王可玲,尤 锋,等.鲈鱼群体生化遗传学研究Ⅰ.同工酶的生化遗传分析[J].海洋与湖沼,2001,32(1):42-49.
[5] 李永通,向应海,杨应勤,等.中国大鲵及鳖不同组织LDH同工酶的比较研究[J].动物学杂志,1992,27(1):28-31.
[6] 肖调义,陈清华,陈开健,等.四种黄颡鱼乳酸脱氢酶电泳的研究[J].上海水产大学学报,2004,13(1):72-74.
[7] 黄生明,秦长庚,潘淑英,等.滇池高背鲫和方正银鲫酯酶、乳酸脱氢酶同工酶的比较研究[J].动物学研究,1988,9(1):69-72.
[8] 周春花,徐毛喜,欧阳珊.池蝶蚌(Hyriopsis schlegeli)与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)若干生物学性状比较研究[J].江西科学,2003,21(2):122-124.
[9] 韩 庆,张建平,陈小丹,等.洞庭湖鲇不同组织SOD同工酶的比较研究[J].水生态学杂志,2010,3(3):150-152.
[10] 罗 洁,盛军庆,邱齐峻,等.人工选育池蝶蚌的EST和MDH同工酶分析[J].水生态学杂志,2008,1(2):48-51.
[11] 王 静,洪一江,王军花,等.不同年龄池蝶蚌(贝)与三角帆蚌同工酶的比较[J].科学技术与工程,2005,5(4):204-209.
[12] 陈淮杨,刘望夷.从超氧化物歧化酶的分布和结构看其分子进化[J]. 生物化学与生物物理进展,1996,23(5):408-413.
[13] 母昌考,崔 雪,戴余军,等.克氏原螯虾 EST 同工酶的组织特异性研究[J].水利渔业,2008,28(1):47-48.
[14] 罗 文,郑大恒,钱伟平,等.2种育珠蚌遗传多样性分析[J].水生态学杂志,2008,1(1):88-92.