摘要:简述了人工诱导淡水鱼类雌核发育的原理、方法,阐述了目前淡水鱼类人工雌核发育在应用方面的进展以及存在的主要问题。
关键词:人工诱导雌核发育;淡水鱼类;染色体
中图分类号:S917文献标识码:A文章编号:0439-8114(2011)07-1430-04
Application of Artificially Induced Gynogenesis on Research of Freshwater Fish
ZHANG Long-gang,LI Xian,FU Pei-sheng
(Key Laboratory of Geretic Breeding of Fresh Water Aquatic,Fresh Water Fishery Research Institute of Shandong Province, Jinan250117, China)
Abstract: The principle and method of freshwater fish artificial gynogenesis were described. Furthermore, the progress as well as difficulties of the application of artificial gynogenesis on freshwater fish were summarized.
Key words: artificial induced gynogenesis; freshwater fishes; chromosome
淡水鱼类增养殖是内陆水产业的重要组成部分,近几十年来,由于水域环境污染加重以及渔业捕捞强度不断增加,鱼类资源面临严重威胁。因此,除了对传统的捕捞渔业加以限制和改进之外,必须大力发展水产增养殖业,积极开展鱼类育种研究工作,培育出优良的新品种。近几十年来,生物技术的发展加速了鱼类的细胞工程育种和基因工程育种研究,使育种工作呈现出崭新的面貌。
人工诱导雌核发育技术于20世纪50年代后期首先从国外发展起来,70年代末期,我国首先从淡水鱼着手开始了这一领域的研究。30年来,已取得了丰硕的成果,3个红鲤雌核发育纯系的建立以及异育银鲫的选育与推广,说明我国鱼类雌核发育研究无论从理论上还是从应用上都取得了长足的进步[1,2]。目前,国内外水产学者通过人工诱导淡水鱼类雌核发育,已经成功地培育出草鱼[3]、斑马鱼[4]、罗非鱼[5,6]、稀有鮈鲫[7]、锦鲤[8,9]、虹鳟[10]、泥鳅[11]、匙吻鲟[12]等经济鱼类的克隆品系,为养殖新品种的开发以及性别决定机制、单性生殖等研究提供了极为宝贵的资料。
1人工诱导雌核发育
1.1人工诱导雌核发育的原理
人工诱导雌核发育(Artificially induced gynogenesis)是指采用物理或化学方法使精子遗传失活,再以这种精子激活卵子,但精子不参与合子核的形成,卵子仅靠雌核发育形成胚胎并通过染色体加倍获得正常的雌核发育后代。但许多学者的研究证明,失活的异源精子在雌核发育子代中存在异精生物学效应(Allogynogenetic biological effects)[13,14],在有些种类中甚至有了父本的遗传物质整合到雌核发育鱼在基因水平上的证明[15]。
1.2人工雌核发育的诱导
人工诱导两性繁殖鱼类的雌核发育包括两个方面:精子染色体的遗传失活以及卵子染色体的二倍体化。
1.2.1精子染色体的遗传失活精子染色体的遗传灭活方法目前主要有物理方法和化学方法。其中,物理方法包括γ射线、X射线以及紫外线(ultraviolet,UV)。各有其优缺点:γ射线与X射线具较好的穿透力,方便对大量精子的处理,它们主要起诱发染色体断裂的作用,经X射线处理过的精子生存力和受精力都较差,在雌核发育的胚胎中还可能存在大量的精子染色体碎片;而紫外线则比较容易操作,它比γ射线和X射线危险性小,主要作用在DNA上,经紫外线照射后的DNA,局部结构变形,从而严重影响DNA的正常复制和转录。但紫外线的穿透力较差,还可能出现光复活作用,导致精子遗传物质失活不彻底,使雄性个体的某些DNA片段参与遗传,在某种意义上阻碍了人工雌核发育研究的进一步深入。化学方法主要是用化学药物处理使精子遗传物质失活,常用的化学药品有甲苯胺蓝(Toludine blue)、乙烯脲(Ethylene urea)、二甲基硫酸盐(Dimethyl sulfate)以及丫啶黄(Trypaflavine)和噻嗪(Thiazine)等[16]。比较而言,化学药物的处理效果不及辐射处理。
1.2.2卵子染色体的加倍刘建康等[17]报道,一般来说正常两性繁殖鱼类排出的成熟卵子正处在第二次成熟分裂中期,此时的卵子仅含有减半的染色体数目,使用灭活后的精子和正常卵子“受精”后的卵子仅有1套染色体组,如果不进行染色体的加倍,胚胎最终表现出有一系列遗传缺陷的单倍体综合征(hapolid syndrom)。典型的形态学特征表现为躯体弯曲、较短,头、躯干、尾三者比例失常,围心腔扩大,水肿,色素减少,血液循环系统不健全等。尽管能通过胚胎发育,但是至孵化期前后即大量死亡,所以要得到正常的雌核发育二倍体后代必须进行染色体的加倍,即在胚胎发育过程中抑制第一次卵裂或阻止第二极体的排出。常用的加倍方法包括物理方法(温度休克、静水压)、化学方法和生物方法(杂交)。
温度休克就是用高于或低于卵子的最适发育温度的方法处理胚胎的技术。在鱼类中,受精卵的温度休克已被广泛用来阻止第二极体的排出或抑制第一次卵裂。Kyle等[18]采用热休克的方法(29℃,10 min)诱导出虹鳟的雌核发育二倍体。静水压法需要专门的设备(如水压机),一次处理的卵子数量有限,但由于它对胚胎的损伤小,比较受欢迎。楼允东等[19]利用静水压法诱导雌核发育二倍体虹鳟,平均孵化率是43.9%,而热休克的孵化率为21.5%。但是利用静水压法诱导雌核发育需要专门的设备,操作复杂,因此无法普遍推广使用。目前雌核发育的研究大多仍采用温度休克的方法,通常是冷水性鱼类用亚致死温度热休克较好,热带鱼类用亚致死温度冷休克较好。
化学药物也可以用于抑制卵子的减数分裂或受精卵的有丝分裂,从而诱导产生雌核发育二倍体。如用秋水仙碱(Colchicine)和细胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)都是有效的,Refstie等[20]用细胞松弛素B处理鲑鱼和虹鳟的卵子,发现细胞松弛素B的剂量为10 g/mL时效果最佳。
不同种之间的鱼类由于亲缘关系较远可导致杂交不亲和,其结果多为精卵不结合所致,由此用异源精子授精即远缘杂交有可能诱发雌核发育。这在很多鱼类的雌核发育研究中已经得到了证实。如蒋一珪等[21]用兴国红鲤进行以方正银鲫为母本的属间“杂交”得到了异育银鲫。
1.3人工雌核发育二倍体的鉴别
由于人工失活精核染色体的处理并非百分之百成功。因此当人工诱导雌核发育时,必须有充分的证据证明精核确实没有对胚胎提供遗传物质。目前,鉴别的方法主要有:①染色体计数和组型分析。若是雌核发育,囊胚细胞中只有一套来自雌核的染色体,为单倍体;如果是杂交二倍体,则有来自雌核和雄核的各一套染色体。根据染色体的大小、形态及着丝点的位置等特征,可以将雌核发育二倍体与杂交二倍体区别开来。②流式细胞计数法。使用流式细胞仪(Flow cytometry)快速鉴定倍性的有效性已经得到了广泛的认可。③显微荧光光度计(microfluoromentry)。通过测定荧光强度,比较DNA的相对含量,可以测定雌核发育二倍体的倍性。④红细胞(核)体积测量法。赵如榕等[22]应用流式细胞术和红细胞(核)体积测量法对雌核发育草鱼、普通草鱼、湘江野鲤染色体倍性进行比较研究。⑤生化水平或分子水平上,寻找雌核发育个体与杂交个体特异性的遗传标记。目前,分子遗传标记技术发展很快,各种DNA分子遗传标记应运而生,如mtDNA分子标记、RFLP、微卫星DNA标记等,比用常规方法如外部形态特征、受精细胞学、染色体数目、红细胞大小和生化遗传标记等更为灵敏。陈洪等[23]应用随机扩增DNA即RAPD技术能够把由方正银鲫(♀)×兴国红鲤(♂)产生的后代异育银鲫与其亲本区分开来;而用常规方法如外部形态特征、受精细胞学、染色体数目、红细胞大小和生化遗传标记等均无法区分。
1.4国内外研究历史及现状
近30年来,人工诱导雌核发育作为快速建立纯合系、克隆的有效手段受到各国学者的极大关注。鲤鱼是鱼类中较早被用于雌核发育研究的种群,早在1978年,Nagy等[24]通过冷休克抑制第二次减数分裂对普通鲤鱼诱导雌核发育并且获得成功。Komen[25]利用射线失活精子结合抑制第一次减数分裂也获得了普通鲤鱼;Gomelsky[8,9]在1996年和1998年2次对锦鲤进行人工诱导雌核发育。在国内,吴清江等[26]利用冷休克和秋水仙素处理这2种方法阻止第二极体的排出,都成功得到了普通鲤鱼的雌核发育。2008年,程果等[27]利用冷休克法诱导黄河鲇二倍体雌核发育,受精后5 min开始、持续处理40 min的条件下冷休克诱导得到二倍体黄河鲇最高8.5%的成活率。2009年,肖俊等[28]利用团头鲂精子诱导金鱼雌核发育取得成功,成活率为6.2%。2002年,贾方钧等[7]利用热休克法及红鲤的异源精子诱导稀有鮈鲫雌核发育,得到了极体雌核发育和有丝分裂雌核发育的存活个体。2001年,邹曙明等[29]利用冷休克法对团头鲂良种“浦江一号”进行雌核发育试验,并成功地生产了一定数量的雌核发育鱼,建立了团头鲂良种雌核发育群体。2009年,邹远超等[12]利用施氏鲟精子诱导匙吻鲟雌核发育取得成功,幼鱼成活率最高为15.6%。2006年,吴风瑞等[30]对南方鲇进行雌核发育研究,认为紫外线照射精子15 min,热休克起始时间为受精后5 min,持续时间为1 min,休克温度为41℃,对人工诱导南方鲇雌核发育最有利。2007年,刘汉勤等[31]利用性逆转和雌核发育技术从XY雌鱼雌核发育产生YY超雄黄颡鱼。
2人工诱导雌核发育在淡水鱼类遗传育种中的应用
2.1快速建立纯系
雌核发育是快速获得纯系近交系的有效途径,已被国内外广泛应用。在传统的育种方法中,建立一个遗传纯系或选育系一般要通过连续数代的近亲交配来完成。这是一项长期而严密的工作,不单需要养殖大量的后代,而且鱼类成熟周期长,需要长时间的日照,另外还会因近亲交配衰退及饲养条件限制对部分个体的淘汰而造成部分育种材料的丢失。而利用连续2代的雌核发育结合性别人工控制方法,就可以建立一个纯系。早在1981年,吴清江等人[28]就提出这个技术方案,即经过连续的人工雌核发育后,借助雄性激素把部分个体转变为“生理雄性”个体,这些“生理雄性”个体和同胞姐妹交配就可以得到纯系。
2.2基因定位
在人工雌核发育过程中,虽然精子经紫外线照射或其他处理,但仍可能会有极少量的染色体片段上的基因并未失活,并有可能在雌核发育后代中得以表达,这就为研究基因的表达提供了方便,若结合显带技术,就有可能确定这些片段在染色体的位置,从而有助于基因的定位研究。
2.3性别决定机制的鉴定
鱼类属于低等脊椎动物,其性染色体异形的分化及性染色体机制尚处于低等阶段,因而鱼类遗传性别的染色体决定机制比较复杂。采用传统的方法对鱼类,特别是染色体细小且数目众多的鱼类进行性别遗传机制的鉴定,存在一定的困难。人工雌核发育技术为确定鱼类的性别遗传机制提供了一条便捷的途径。采用这一技术,只需确定人工诱导雌核发育所获得的子代的性别就可以了。如果雌核发育后代全为雌性,表明该种群的雌性为配子同型,比如对于XY决定型来说,其雌性为XX型;如果雌核发育后代或全为雄性(ww型后代不能成活),或雌雄各占一定比例(ww型全部或者部分成活),则表明该种群的雌性为配子异型,如ZW决定型的雌性。Campos-Ramos等[6]应用人工雌核发育技术并结合性转换和荧光原位杂交技术来研究莫桑比克罗非鱼的性别决定机制,发现常染色体对其性别决定有影响作用。
2.4性别控制
在鱼类生产中,有些单性群体具有生长速度快,经济效益高,可控制群体过度繁殖等优点,用雌核发育的方法生产单一雌性群体,可大大降低生产成本,提高养殖效益。如罗非鱼,因其雄鱼比雌鱼长得快,并且性成熟早,易繁殖,进行单性养殖,不仅可以提高单位面积产量,而且可以控制其繁殖速度,进而控制养殖密度。另外,单性养殖减少了生殖能量的消耗,从而提高上市商品鱼的规格和肉质。但就现阶段而言,由于二倍体出现的频率低,单靠人工诱导雌核发育技术还不能满足实际生产的需要。
2.5提高选种效率
雌核发育还有利于提高选种效率。任何鱼类的种群个体都含有一些有害的隐性基因或致死基因,在选育中很难除去这些基因。雌核发育后,由于基因座位的纯合化,有害隐性基因控制的性状就会表达出来,因此很容易从群体中除去这些带有有害隐性基因的个体,致死、致病的隐性基因就会被淘汰,从而选育出抗病能力强的新品系。异源精子生物学效应的存在使得利用人工雌核发育技术通过种内或种间的基因交换来培育新的优良品种成为可能。如桂建芳等[32]在银鲫雌核发育的调控研究中,发现采用冷休克等方法处理受精卵可以提高异源精子DNA掺入和整合到银鲫基因组中的成功率,并在子代中显示出比异育银鲫更为明显的体型变化和生长加快等生物学效应。
2.6保护濒危物种
有些已经濒临灭绝的鱼类,繁殖效率很低,通过性别控制可确定有效的繁殖性别比例,从而起到扩大种群保护种质资源的目的。随着生殖医学研究的深入,卵子冷冻技术已经比较成熟,其作为辅助生殖领域的一项前沿技术,正在被越来越多的国家采用,有着广泛的应用前景。卵子中保存有亲鱼的所有基因,理论上来说,雌核发育技术可以从被冷冻保存的卵子中恢复种群资源,甚至是已经灭绝的动物,我们也可考虑用先前冷藏的卵子与其亲缘关系较近的动物灭活精子进行雌核发育,使其种群得以恢复。
3结语
目前,人工诱导雌核发育在淡水鱼类养殖中的应用已取得了一定的进展。但同时也必须看到淡水鱼类雌核发育仍存在某些问题,比如,国内有关人工诱导雌核发育的淡水鱼类大部分集中在鲤鲫等常规鱼类和一些模式淡水水产动物,对一些名特优淡水种类以及高档观赏鱼中的研究较少。雌核发育成功并真正传至子代并稳定遗传的较少,大部分研究仅停留在诱导方法和检测手段,仔鱼出膜后的后续报道较少;由于紫外线穿透力较差,可能出现光复活作用,导致精子遗传物质失活不彻底,使雄性个体的某些基因参与遗传,在某种意义上阻碍了人工雌核发育的深入研究。因此,雌核发育的理论基础和应用技术仍需进一步深入研究和完善。只有对包括配子形成,精、卵核发育,以及整个雌核发育过程中的各种生理、生化反应进行深入的探索,才能建立完整的人工诱导雌核发育调控模式。另外,利用雌核发育培育新品种方法比较单一,可以利用雌核发育结合其他生物育种技术,以期望在淡水鱼类育种方面取得突破性进展。
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