摘要:以MS+6.79 μmol/L2,4-D+22.19 panol/L 6-BA为诱导培养基,以花生成熟种子子叶为外植体,诱导出大量丛生芽和少量体细胞胚;组织细胞学观察发现,子叶外植体不经过愈伤组织,直接诱导分化出丛生芽和体细胞胚,属于直接发生途径;并且子叶丛生芽和体细胞胚起源于外植体表皮或皮层细胞,为外起源方式。
关键词:花生;不定芽;体细胞胚;组织学观察
中图分类号:Q813.1+2 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2011)02-0007-04
花生是世界范围内广泛种植的豆科植物,是人类食用油和食用蛋白的主要来源之一。花生栽培品种为异源四倍体,常年人工选择致使其种质遗传背景狭隘,因此,单纯通过传统育种手段很难打破瓶颈实现大的突破。多年实践证明,基因工程结合传统育种可以在较短的时间内实现优异性状或基因在不同物种间的转移,实现定向、精准地改良作物品质和抗性性状。
高效的植株再生技术是植物基因工程必要的前提条件之一。花生离体培养技术自20世纪50年代Steward培养花生韧皮组织细胞开始,至今已有不少关于花生成功获得再生植株的报道。sharma等(2000)以成熟种子子叶为外植体,在含有20 panol/L 2,4-D的MS诱导培养基上从子叶节伤口处诱导出大量芽点。Mckendy等(1991)和Livingstone等(1995)分别以花生8日龄苗幼叶和成熟种子胚小叶为外植体诱导不定芽获得成功。方小平等(1995)对Livingstone方法加以改良,以萌发4 d的小叶在含3mg/LBAP+1 mg/L NAA的MS培养基上诱导芽分化成功,芽诱导率提高到86%~100%。庄振宏等(2001)以4日龄花生小叶为外植体做进一步探索,从25种培养基中筛选出5 mg/L 6-BA+2.5 mg/L NAA为最佳长芽点组合,5 mg/L6-BA+1.0 mg/L NAA为最佳愈伤组织诱导组合,并发现胚小叶是诱导长芽的最佳外植体。另外,董金铎等(1989)利用3个类型花生品种种子的胚根、胚轴、子叶等外植体进行愈伤组织诱导和分化,用于比较花生类型间和不同的组织器官分化再生能力,发现所有的外植体均能产生愈伤组织,除胚根外其他3种外植体的愈伤组织均能分化出不定芽,尤以胚芽的愈伤组织分化能力为最强。汪强等(2001)以花生茎尖为外植体进行诱芽和诱根培养,结果表明2,4-D可促进愈伤组织增生,但无诱根效果。除对不定芽的成功诱导报道外,关于体细胞胚的研究也很多。Ozias-Akins(1989)以花生未成熟胚为外植体,在含0.5~2.0 mg/L Piclorarm的培养基中,50%~60%的外植体可诱导形成体胚,获得再生植株,并发现Piclorarm对促进体胚再生有重要作用。Liv,ingstone等(1995)用5 mg/L Piclorarm诱导花生胚小叶产生体胚获得成功。晏立英等(2000)以成熟胚为外植体,在含20 mg/L 2,4-D或5 mg/LPiclorarm的MS培养基上胚性诱导率达到55%~78%。研究进一步发现不同浓度2,4-D对体胚诱导也有较好作用,Hazra等(1994)和Baker等(1989)分别通过不同浓度的2,4-D诱导未成熟种胚形成体胚,并且体胚多产生于胚小叶基部,花生品种间体胚诱导率差异较大。Chengalrayan等(1994)则利用较高浓度(20 mg/L)2,4-D诱导胚性愈伤,转到3 mg/L 2,4-D诱导产生体胚。
以上报道均为基于建立高效花生再生体系所做的研究,而关于花生体细胞胚胎发生和再生芽发生的组织细胞学研究少有报道。本研究以花生成熟种子子叶为外植体,直接诱导产生体细胞胚及丛生芽,并对它们的发生过程进行了组织学和细胞学观察,以期为探讨体细胞胚和再生芽的发生机理和发育特点提供实验证据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
鲁花14号,由山东省花生研究所提供。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体的制备 选取籽粒饱满的成熟花生荚果,去壳,蒸馏水浸泡30 min,75%乙醇消毒30 s,无菌水洗涤2次,0.1%HgCl2消毒15 min,无菌水洗涤3次,去种皮,分开两片子叶,切除胚,并在着生胚处划伤子叶,每粒种子可产生两个外植体。
1.2.2 培养基和培养条件制备好的子叶外植体切端朝下植入诱导培养基MS+6.79 μmol/L2,4-D+22.19 μmol/L6-BA,当不定芽长至1~2 cm,转入茎伸长培养基MS+8.88 μmol/L6-BA+11.56 gmol/L GA3,外植体在含有10.75μmol/L NAA的MS培养基上生根。所有培养基在加入琼脂前用1 mol/L NaOH或HCl调节pH5.8,121℃高压蒸汽灭菌20 min。丛生芽每3周继代培养1次,所有外植体在培养瓶内16h光照,(25±2)℃条件下培养。
1.2.3 组织切片的制备与观察 用体视显微镜(LEICA S8AP0)观察具丛生芽的子叶,并拍照。取0.3~0.5 cm培养20 d的具丛生芽的子叶顶端部分,在FAA固定液(甲醛:冰醋酸:70%乙醇=1:1:18)中固定24 h以上,梯度乙醇脱水,透明后浸蜡,包埋入熔点为57~59%的石蜡。修整蜡块,沿再生芽发育的纵向切片,切片厚度为8μm。将切片铺在玻片上,熔蜡,番红精(1%,v/V)和固绿(0.5%,V/V)对染。光学显微镜(Ni,kon Eclipse TE2000-E)下观察并拍照。
2 结果与分析
2.1 丛生芽的诱导和发生
将子叶外植体接种于芽诱导培养基,2~3天后子叶开始膨大变绿。2周后部分外植体切口上出现深绿色突起状芽点,4周后有丛生芽出现,而且芽点继续形成(如图版I:1)。解剖镜下进行观察,可见这些芽绝大多数为正常不定芽,少数的芽呈叶状畸形(图版I:2)。当丛生芽长至1~2am时,将丛生芽从外植体切下转入芽伸长培养基(图版I:3),大约2~3周,丛生芽长至3~5 cm时,再将芽单株分开转至生根培养基,3~4周后根诱导长出。最后生根的小苗移栽到盆内,在温室生长(图版I:4)。
2.2 组织细胞学观察
组织切片显微观察发现,子叶外植体的切口表层细胞首先接触到培养基,形成一团活跃的细胞,表现为体积相对变小,形状规则,排列紧密,细胞质浓厚,细胞核增大,核仁明显。继续培养,细胞分裂活动扩散到子叶其他部分的叶肉组织,形成大量分散的分生细胞团,进一步发育,分生细胞团常可分化形成不定芽;有些表皮细胞和皮层细胞则快速分裂,并突破表皮形成体细胞胚(图版I:5、6)。
3 讨论与结论
3.1 发生途径
植物组织培养中诱导丛生芽或胚状体发生的途径可归纳为两种:一种是直接发生途径,即从外植体的某些部位可直接诱导分化出丛生芽或胚状体,如槐树子叶、烟草叶片和叶柄、山茶子叶、白车轴草幼胚和石龙芮下胚轴等;另一种是间接发生途径,即由外植体的细胞先脱分化形成愈伤组织,再从愈伤组织的某些细胞分化出胚状体或丛生芽,如猕猴桃茎段、油菜花序轴和叶片、番茄子叶和杨树叶片等。本研究用6.79μmol/L2,4-D和22.19μmol/L 6-BA诱导花生子叶的丛生芽和胚状体的发生属于前一种,分化芽的频率高、速度快、周期短,在无性系快速繁殖上有很大应用价值。
3.2 起源方式
丛生芽和体细胞胚的起源目前报道有以下两种方式:内起源和外起源。已经报道大多数植物芽原基和原体胚细胞由表皮细胞或皮下组织形成,即为外起源方式,但也有少数植物的茎或根的切段培养中,芽原基起源于切口处的形成层细胞、韧皮部或维管薄壁组织,即内起源方式。如烟草、油菜、番茄和凹叶景天。本研究在花生子叶上诱导的丛生芽和体细胞胚均起源于外植体的表皮细胞或皮层细胞,为外起源方式。
3.3 激素对花生子叶丛生芽和体细胞胚的诱导
本试验中,在22.19μmol/L 6-BA和6.79μmol/L 2,4-D的诱导下,外植体子叶上形成大量不定芽和少数体细胞胚,并且继续培养后大部分不定芽可进一步伸长、生根,发育成独立的植株,而体细胞胚大多发育至球形胚阶段即停止发育,不能正常成熟、分化,推测高细胞分裂素和低生长素的条件有利于不定芽的发生,而不适于胚状体的诱导。这与詹祥灿(1983)和王喆之等(1993)的研究结果一致。另外,所得到的不定芽中有一部分为叶状或畸形,不能正常发育成植株,说明该花生再生体系仍不完善,尚有待于进一步研究。