摘 要 小型波长检测型表面等离子体共振(SPR)分析仪采用固定光的入射角, 监测共振波长变化的测量模式, 可进行多波长同时测量。设计并组装了SPR分析仪中的微型光纤光谱仪, 采用光导纤维输入被测光, 固定全息衍射光栅分光, 线阵CCD光电传感器检测, 可检测的波长范围是500~900 nm, 分辨率0.23 nm。自行编制了控制传感器数据采集和处理的计算机软件, 采用信号强度对波长(实际谱图中的横纵坐标)收集实验数据。SPR分析仪不仅小型化, 且具有良好的分析性能, 可用于定量分析生物分子间相互作用的研究, 对人免疫球蛋白(IgG)进行了实时检测, 采用3种不同的方法所得到人IgG的最低浓度达到0.15 mg/L, 并对仪器的稳定性、样品的生物活性等因素进行了考察。
关键词 表面等离子体共振; 微型光纤光谱仪; 波长检测型
1 引 言
表面等离子体共振(SPR)是入射光在两相界面处发生全内反射时的消失波, 可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子体子[1,2]。在入射角或波长为某一适当值的条件下, 表面等离子体子与消失波的频率和波数相等, 二者将发生共振, 入射光被吸收, 使反射光强度急剧下降, 在反射光谱上反射光强度最低点所对应的波长为共振波长。当金属薄膜表面介质折射率不同时, 共振波长也不同[3]。
目前, 应用的SPR商品仪器基本是角度调制型, 测量的角度范围有限, 仪器本身也比较昂贵[4,5]。本研究基于光栅有的高光谱分辨率和光纤的高光传输能力, 且采用光纤可使仪器的设计更加方便, 构型更加紧凑, 宜于仪器的小型化, 成功研制了多波长同时检测型SPR分析仪。本仪器体积小, 重量轻, 波长范围很宽, 可用于定量分析, 特别适于分子间相互作用[6~9]、生物分子与药物分子相互作用[10,11]的研究。设计并组装了与SPR分析仪相匹配的检测器——微型光纤光谱仪, 采用光导纤维输入被测光, 固定全息衍射光栅分光, 线阵CCD光电传感器检测。本仪器既可以应用于SPR仪器作为检测单元, 也可以应用于其它光谱分析领域。
2 SPR分析仪的设计与研制
2.1 仪器结构
多波长同时检测型SPR分析仪如图1a所示, 仪器由光源、导光系统、SPR传感元件、流通池、微型光纤光谱仪和数据处理系统组成。选用卤钨灯作为光源, 从光源发出的白色光经过由2个透镜和1个偏振片构成的平行偏振光管后变成平行偏振光, 通过平行偏振光管的出射端狭缝, 以一定的角度照射到棱镜的侧面上, 经折射后光线到达棱镜的底部(预先用Snell定律计算出保证光线在此界面发生全内反射的入射角度), 底部的外侧镀一层50 nm厚的金属薄膜, 流通池密封在其上面。光线在棱镜与金属的界面处发生全内反射, 然后从棱镜的另一个侧面折射出去, 通过下一个透镜聚焦耦合进入微型光纤光谱仪进行分光检测。波长检测型SPR分析仪可以实现多波长同时检测, 且检测的波长范围不受限制, 这样不仅使传感器表面被检测物质量的范围不受限制, 即折射率变化的范围不受限制, 而且非常有益于生物分子与药物分子、分子与组织(如细胞)间相互的作用的研究。
自行设计并组装的波长检测型SPR分析仪如图1b所示, 仪器的外型尺寸为42 cm×32 cm×13 cm。
2.2 光源
采用固定波长、改变入射角为测量方式的SPR仪器和装置多采用He-Ne激光器(λ=632.8 nm)做光源。发光二极管(LED)也被用作SPR的光源, 波长多选择为760 nm。
对于波长检测型SPR传感装置, 最理想的光源应是可以发射各种波长光的连续光源, 而且强度不随波长而改变, 并具有足够的强度和稳定性, 但实际上很难找到这种光源。在各种连续光源中, 白炽灯光源是最廉价易得的, 并且具有足够稳定的发光强度, 其中, 卤钨灯就很适于做SPR研究的光源。卤钨灯在可见光区有连续发射光谱, 并且由于钨的挥发与沉积的循环过程, 使灯丝不易蒸发损失, 灯的使用寿命较长;其缺点是电流直接流经灯丝, 发光强度受电压的波动影响较大。经过比较, 选择碘钨灯作为光源。
2.3 导光系统和传感元件
导光系统由透镜、偏振片和光纤组成。实验中使用的连续光源可近似看作点光源, 向各个角度发射光, 为了保证入射到棱镜的所有光束的入射角相同, 且可固定在某一特定值, 必须将光源发出的光准直为平行光束, 然后再照射到传感元件棱镜的一个侧面上。因此选择2个小透镜, 见图1a。2个透镜的距离经过计算, 使其焦点重合。
波长检测型SPR分析仪需要使用偏振光, 因此入射光必须经过偏振器起偏, 将一个小的圆形偏振片置于上述的2个小透镜之后, 与2个小透镜共同组成平行光管。在平行偏振光管的出射端加1个狭缝, 调整并固定光源的角度, 使透过狭缝的平行偏振光以一定的角度照射在传感元件棱镜的一个侧面上。
由棱镜另一侧面出射的光经过透镜聚焦后, 引入光纤, 光纤一端置于透镜的焦点处, 使聚焦的光全部进入光纤, 再进入微型光纤光谱仪进行检测。
在组装的SPR分析仪中, 选用玻璃棱镜作为传感元件。对于棱镜的光学材料, 应用最普遍的是光学玻璃。由理论计算可知, 对于SPR研究, 棱镜与介质的折射率差别越大, 测定的灵敏度越高。因此, 为了提高灵敏度应选择折射率较高的光学材料制作棱镜。但是, 高折射率的光学材料, 其表面的机械强
度和稳定性都较差, 在空气中易形成氧化膜。加工了3种不同牌号(中国)的棱镜, 其相近折射率光学材料的牌号和折射率值对照见表1。
从耐用的角度考虑, 选用K9光学玻璃做为棱镜材料。棱镜的形状为半球形时最理想, 它可以保证与半球形底面成0~180°角的入射光线均与界面垂直, 反射光的损失小, 且进入棱镜后光线的角度不变, 但半球形的棱镜加工费用较高。本研究选择容易制作的直角等腰三角形棱镜, 其边长尺寸为2.7 cm×1.7 cm×1.7 cm。
许多金属都可以作为SPR传感元件的金属膜, 而金和银是两种应用较普遍的金属, 并且银膜的灵敏度高于金膜。表2列出了金和银作为SPR传感部位金属膜的性能比较。两种金属膜在使用过程中各有特点。金膜的优点是稳定性好, 不易氧化;与玻璃的粘接性好, 不易脱落;不与反应体系中的各种无机离子发生反应, 从而不影响生物体系的测定结果。金膜的缺点是价格略高, 灵敏度稍差。银膜的优点是灵敏度高, 价格低;缺点是与玻璃的粘着性不好,易脱落;溶解生物样品的缓冲溶液基本为磷酸盐缓冲液(PBS), 其中含有无机离子Cl-, 而过多的Cl-会损害银膜。因此, 对于大多数生物体系的SPR研究, 不宜选择银膜作为基底传感膜。
表3列出了利用K9玻璃时入射波长及其所对应的折射率。从表3可见, 对于500~600 nm的可见光, 折射率会随着波长的增加而减小, 而通常应用传感器的波长范围多在此波段。由于不同波长的入射光在棱镜内的折射率不同, 入射光通过棱镜后, 出射光的位置也不同。分别以500和600 nm的入射波长为例, 计算其出射光进入光纤前光线的距离。根据表3列出的入射光在500和600 nm时的折射率n500=1.5214和n600=1.5163, 可以根据Snell定律:n0sinα0=n1 sinα1, 计算折射角和全反射角; 再根据棱镜的实际长度, 计算得到这两条不同波长的光进入棱镜, 经棱镜折射出时光线的距离为3.675×10-5 m, 该距离不会对反射光的收集产生影响。
2.4 流通池
SPR的研究对象多为生物分子的相互作用, 因此, 流通池的设计原则应是尽可能使体积最小。流通池的几何形状为圆柱体, 直径为12.0 mm, 深度为1.5 mm。实验时, 若样品量较充足(例如测定非生物样品), 最好采用蠕动泵进样, 效果较好。若样品量很少, 为了避免在管路中的浪费, 也可以用注射器直接进样。
2.5 微型光纤光谱仪
微型光纤光谱仪主要包括分光系统和电学系统以及它与数据处理系统、SPR传感元件的接口, 其结构如图2所示。该光谱仪的波长检测范围为500~900 nm, 分辨率为0.23 nm。
光栅是微型光纤光谱仪的“心脏”, 其性能的优劣决定仪器整体的光学性能。在综合考虑各种光栅的价格和性能后, 采用平面全息衍射光栅, 刻线密度为600和1200条/mm;由于波长检测型SPR分析仪需要测量的光谱主要集中在可见波长区, 综合考虑各种检测器的价格和性能, 采用日本Toshiba(东芝)公司生产的TCD1304AP型(3648像素)线阵CCD检测器和日本Sony(索尼)公司生产的ILX554B型(2048像素)线阵CCD检测器。这两种检测器都是高灵敏检测器, 分别具有13和18个暗(光谱遮蔽)像素, 可减小外界温度变化对线阵CCD检测器光强测量结果造成的干扰, 其动态范围(像素饱和输出电压与暗电压之比)分别为300和333;采用美国Analog Devices(模拟器件)公司生产的AD9220型A/D转换器作为电子器件, 其最大转换速率为每秒10 M次, 转换精度为12位并具有溢出指示功能, 最大功耗低于250 mW;采用美国Atmel(爱特梅尔)公司生产的AT91SAM7S64型微处理器, 该处理器采用ARM7TDMI处理器核心, 高性能32位精简指令集架构, 具有低性能/功耗比和嵌入式电路仿真功能, 运行频率可达55 MHz, 并且具有USB2.0全速接口和大量其它接口。
微型光纤光谱仪采用紧凑的Czerny-Turner光路设计以减小光学平台尺寸。入射光由一个标准的SMA905光纤接口进入光学平台, 经球面反射镜1准直, 然后由平面光栅分光, 经由球面反射镜2聚焦到线阵CCD检测器上。
微型光纤光谱仪的电学设计目标是低功耗、稳定可靠和抗干扰能力强。在电学设计时采用了以下方式:(1)电路中的强、弱电和交、直流电分开走线, 以避免彼此间的干扰;(2)各芯片的电源电路中均加入滤波电容进行滤波;(3)采用质量优良的元器件。
微型光纤光谱仪的外壳和内部光学底座拟采用铸铝材料铸造成型, 光学部件与电学器件分腔放置。在光学腔中, 分光器件和线阵CCD检测器被牢固地固定在光学底座上, 腔内无任何其它电子元件;所有的电路和电学器件被隔离在电学腔中。这样, 既提高了光学系统的稳定性和电学系统的抗干扰能力, 又使光学部件和电学器件的调试过程互不干扰。
微型光纤光谱仪采用的是嵌入式系统固件设计, 嵌入式系统固件的主要功能有:(1)通过处理器的多个I/O端口控制仪器的各种逻辑状态;(2)通过处理器的地址线和数据线读取A/D转换器转换出的数字信号, 并进行一定的预处理(如判断是否溢出等);(3)通过微处理器的USB接口接受PC机发出的命令, 并向PC机传送光谱数据;(4)通过仪器跳线的设置判断并启动自升级功能。
2.6 数据处理系统
自行编制了控制传感器数据采集和处理的计算机软件, 采用信号强度对波长(实际谱图中的横纵坐标)收集实验数据。计算机程序从数据采集卡端口读取信号强度, 一定时间间隔内读取多次, 以平均值作为强度值, 由多个数据点组成一副谱图。利用控制软件在谱图上选择一个可用的数据范围, 在数据范围内对横纵坐标的数值进行六次多项式拟合, 以拟合结果和实际数据点的相对标准偏差最小为拟合终点, 从而可以得到一个六次曲线函数。接着, 计算机程序对该函数进行求导数处理, 得到一个五次函数, 这时令函数中Y=0, 就可以得到一个五次方程, 求得的X值就是得到六次拟合函数取极值(一定区间范围内的最大值、最小值)时对应的横坐标。采用二分法可以对该五次方程进行求解, 以两次二分值的差值和二者平均值的比值小于10-7为求解终点。将这个值代入拟合得到的六次函数, 可求得纵坐标值。如果该函数有多个极值, 可采用多段区间分别求解的方法逐个得到极值的坐标。这样就可以得到实验所需的最低点及其对应的强度值。
3 结果与讨论
3.1 人IgG的检测
分别采用金膜以及Au纳米粒子和Au/Ag合金纳米粒子修饰的金膜作为传感器的基底膜, 检测人IgG与其抗体的结合。在室温下, 首先通过共价结合将兔抗人IgG固定在生物传感器的表面, 再将PBS缓冲溶液稀释的不同浓度的人IgG分别加入到流通池中, 使抗原能够与固定在生物传感器表面的抗体结合。抗原与固定在表面的抗体结合的量可由共振波长的变化测得。
在室温下, 兔抗人IgG连接在生物传感器表面以后, 不同浓度的人IgG分别注入到流通池中, 实时记录由于抗体-抗原免疫反应所引起共振波长的变化。图3显示了共振波长变化与人IgG浓度之间的关系。基于Au膜的传感器检测到人IgG的浓度范围是1.25~20.0 mg/L;基于Au纳米粒子修饰的传感器所检测到人IgG的浓度范围是0.30~20.0 mg/L;基于Au/Ag合金纳米粒子的传感器所检测到人IgG的浓度范围是0.15~40.0 mg/L。以上实验结果表明纳米粒子在修饰SPR传感器中具有的显著优势。 3.2 仪器的稳定性
为了测试传感膜的稳定性, 多次对于同一浓度的IgG与其抗体的免疫结合进行检测。若传感器金膜表面未固定抗体时, 共振波长为λ, 固定抗体后, 共振波长为λ1, λ1-λ即为固定抗体的最大位移值Δλ。以此固定抗体的传感器用于检测抗原, 检测一定次数后, 将抗原洗脱, 此时共振波长为λi, 位移值为Δλi=λi-λ, (Δλ-Δλi)/Δλ×100%即为传感膜稳定性变化的百分率。实验结果表明, 在对人IgG进行检测的24 h内, 固定在传感膜上的抗体有少量的流失, 稳定性约降低2%。检测持续4 d后, 传感膜的稳定性约降低4%。随着时间的推移, 传感膜活性降低, 主要是由于在检测过程中缓冲溶液将少部分的抗体冲掉而造成的。同时, 生物试剂自身的活性也会随时间的推移而略有下降, 但这些因素对于检测的影响可忽略不计。
3.3 小结
研制了以固定入射光角度, 监测共振波长变化为操作模式的SPR分析仪, 仪器结构简单、造价适中、宜于普及, 特别适于分子间相互作用的研究。应用SPR技术生物样品无需标记, 且具有能实时监测反应动态过程、灵敏度较高、无背景干扰等特点。SPR分析仪的研制对SPR方法和仪器的发展及应用具有一定意义。
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Design and Development of Miniaturized Wavelength
Modulation Surface Plasmon Resonance Analyzer
SUN Ying, CAO Yan-Bo, WANG Xing-Hua, ZHANG Han-Qi, YU Ai-Min, SONG Da-Qian*
(College of Chemistry, Jilin University, Changchun 130012)
Abstract A miniaturized multi-wavelength modulation surface plasmon resonance (SPR) analyzer was developed by our laboratory. The incident angle of light was fixed and the change in the resonant wavelength was real-time monitored. The multi-wavelength measurement can be performed. The minor optic fiber spectrometer was designed and developed. The test light was input using optical fiber; the holographic diffraction grating was fixed for spectrophotometric; linear CCD optical sensor was used for detection. The wavelength range that can be detected is 500–900 nm and the resolution is 0.23 nm. The computer software of control sensor data acquisition and processing were self-developed. The experimental data were collected with the signal strength to the wavelength (the actual spectrum of horizontal and vertical coordinates). The SPR analyzer is not only small, but also has good analytical performance for quantitative analysis of biomolecular interaction studies. The human immunoglobulin (IgG) was detected in real-time. With three different methods, the lowest concentration of 0.15 mgm/L of human IgG that can be detected. Meanwhile, the stability of the instrument, the effect on sample biological activity and other factors were also studied.
Keywords Surface plasmon resonance analyzer; Minor optic fiber spectrometer; Wavelength modulation
(Received 30 June 2011; accepted 20 August 2011)