摘要:[目的]为评价瑞鲍迪甙A作为饲料甜味剂的安全性,进行了瑞鲍迪甙A大鼠、小鼠的急性毒性及亚慢性毒性试验。[方法]急性毒性试验采用灌胃给予;亚慢性毒性试验中,瑞鲍迪甙A以20、4和1 g/kg拌料给予大鼠90 d,每周称量大鼠体重和饲料消耗,并在喂养45和90 d时剖检,分别进行血液细胞学和血液生化指标检测,计算主要脏器系数以及进行相应的组织病理学检查。[结果]瑞鲍迪甙A对大、小鼠的经口LD50分别大于34.0 和45.0 g/kg b.w.;亚慢性毒性试验各剂量组大鼠的采食、体重、脏器系数、血液细胞学及血液生化指标、大体解剖及组织病理学检查结果与正常对照组比较无明显差异。[结论]瑞鲍迪甙A属于实际无毒级别物质,亚慢性毒性试验对大鼠无明显有害作用。
关键词:瑞鲍迪甙A;急性毒性;亚慢性毒性
中图分类号 S567 文献标识码
A 文章编号 0517-6611(2015)02-103-03
Studies on the Acute and Sub-chronic Toxicity of Rebaudioside A
LI Nan1, WANG Jian-ming1,2,ZHOU Ze-wei1,ZHANG Yu-mei1,2* et al (1.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009;2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou, Jiangsu 225009)
Abstract [Objective]To evaluate the safety of rebaudioside A sweetener used as feed additives, the oral acute toxicity and sub-chronic toxicity tests to mice and rats were studied. [Method]Acute toxicity tests were administered orally.Rebaudioside A was administered with mixture of feedstuffs for 90 d at doses of 20, 4, 1 g/kg to rats in sub-chronic toxicity test. The weight and feed consumption were measured every week. The hematological and biochemical examination, organ coefficient and histopathologic analysis were made at 45 th and 90 th day of test period.[Result]The oral LD50 values of rebaudioside A to rats and mice were more than 34.0 and 45.0 g/kg b.w. respectively. The sub-chronic toxicity test indicated that there were no significant difference in feed intake, body weight, organ coefficient, hematological index, blood biochemical parameters, gross anatomy and histopathology between these tested groups and normal control.[Conclusion]The rebaudioside A was belong to nontoxic grade substanct and appeared no obvious sub-chronic toxicity.
Key words Rebaudioside A; Acute toxicity; Sub-chronic toxicity
基金项目 江苏高校优势学科建设工程项目;扬州大学“新世纪人才”工程。
作者简介 李楠(1991- ),男,江苏大丰人,硕士研究生,研究方向:基础兽医学。*通讯作者,教授,博士,硕士生导师,从事基础兽医学研究。
收稿日期 2014-11-27
瑞鲍迪甙A是从混合物甜菊糖苷中分离或直接从甜叶菊提取物中纯化出的甜味剂。瑞鲍迪苷A在甜菊糖苷中约占15%~20%,甜度为蔗糖的450倍,甜味较纯正,且甜味最接近蔗糖,其他组分含量均较少。甜菊糖苷类高甜度低热量的特点,作为蔗糖的替代品在食品中应用越来越多[1]。研究表明瑞鲍迪甙A的吸收和代谢主要在肝肠,而排泄途径主要是通过粪便排出[2-3]。目前有不少研究表明瑞鲍迪甙A有降血压和降血糖的作用[4-5]。
由于甜菊糖苷类的规格资料不足,代谢物甜菊醇体外试验中表现出致突变性[6-7],对其应用安全性存在着争议[8]。至2008年,在联合国粮农组织、世界卫生组织食品添加剂专家委员会(JECFA)第69届会议上,确定了甜菊糖苷每日允许摄入量(ADIS)为0~4 mg/kg体重(以甜菊醇表示)[9]。同年,美国药品食品管理局(FDA)批准允许在食品中使用甜叶菊提取物瑞鲍迪苷A。2012年,法国成为欧盟第一个批准在食品和饮料产品内使用高纯度瑞鲍迪苷A(97%)的国家[10]。但目前国内对瑞鲍迪苷A的研究和其在食品中的应用还相对较少。为进一步了解瑞鲍迪甙A的使用安全性,该试验研究瑞鲍迪甙A对大小鼠的急性毒性和亚慢性毒性,为评价瑞鲍迪甙A作为饲料甜味剂的安全性及临床应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 受试药物
瑞鲍迪甙A,批号BZR2012-002P,白色粉末,由上海某生物科技有限公司提供。临用前以1%羧甲基纤维素钠溶液配制成受试物混悬液。
1.2 试验动物
ICR小鼠(清洁级),体重18~22 g,Wistar大鼠(清洁级),体重180~220 g,由扬州大学兽医学院比较医学中心提供,动物生产许可证号SCXK(苏)2012-0004,使用许可证号SYXK(苏)2012-0029。饲喂经60Co照射饲料,24±2 ℃,湿度(60±20)%,自由采食和饮水,饮水为符合城市饮用水标准的自来水。试验前在试验环境中适应3 d,灌胃前停食12 h,不限制饮水。
1.3 方法
1.3.1 大、小鼠经口急性毒性试验。
根据预试验结果,受试品瑞鲍迪甙A对大、小鼠的毒性较小,无法准确测出LD50,依据急性毒性试验技术规范,对受试品进行最大给药量试验。
ICR小鼠,雌、雄各半,各20只,以可操作的药物最高浓度、最大给药容积(0.4 ml/10g b.w.)于24 h内灌胃2次,给药时间间隔6 h,给药总量为45.0 g/kg b.w.,连续观察2周,并记录动物中毒症状及死亡情况。Wistar大鼠,雌、雄各半,各10只,以可操作的药物最高浓度、最大给药容积(0.8 ml/100 g b.w.)于24 h内灌胃2次,给药时间间隔6 h,给药总量为34.0 g/kg b.w.,连续观察2周,并记录动物中毒症状及死亡情况。
1.3.2 大鼠90 d亚慢性毒性试验。
瑞鲍迪甙A经饲料加工厂制作成药料,饲喂90 d。瑞鲍迪甙A分为20、4和1 g/kg(分别相当于100倍、20倍和5倍推荐剂量)3个剂量组;正常对照组饲喂大鼠常规饲料。Wistar大鼠随机分为4个组,每组20只,公母各半。
试验期间观察大鼠的一般行为及饮食,每周称量体重和饲料消耗。分别在喂养45和90 d时进行大体解剖,每组10只大鼠(雌雄各5只),分别取抗凝血进行血液细胞学检测;血清样品进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)、葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)等血液生化指标的检测;并称量心、肝、脾、肺、肾、卵巢子宫、睾丸附睾的重量,计算脏器系数;对肝、肾、脾、肺、十二指肠、睾丸、子宫等主要脏器进行组织病理学检查[10]。
1.4 数据处理 数据采用SPSS19.0软件处理,统计学分析采用ANOVA检验。
2 结果与分析
2.1 急性毒性试验
瑞鲍迪甙A大鼠给药总量为34.0 g/kg b.w.、小鼠给药总量达45.0 g/kg b.w.时,大、小鼠精神状态均良好、毛色光洁、活动自如,呼吸、饮食欲、粪便正常。试验组大鼠及小鼠均未出现死亡,亦未出现与给药相关的异常反应。给药第14天后,对所有动物进行剖检,未见明显的异常。
瑞鲍迪甙A对大鼠的经口LD50>34.0 g/kg b.w.,对小鼠的经口LD50>45.0 g/kg b.w.。根据WHO对化学物质毒性分级标准,瑞鲍迪甙A属于实际无毒级别物质。
2.2 亚慢性毒性试验
试验期内未发现瑞鲍迪甙A试验组大鼠有异常行为和表现。除了喂养90 d时高剂量组总蛋白(TP)和总胆固醇(CHO)低于正常对照组(P<0.05)外,瑞鲍迪甙A各剂量组大鼠的采食、体重增重、脏器系数、血液学指标与正常对照组比较无明显差异(P>0.05);大体解剖及肝、肾、脾、胃肠、睾丸、卵巢等组织病理学检查均未发现异常(表1~8)。可见,瑞鲍迪甙A在1~20 g/kg添加水平,喂养Wistar大鼠90 d时,未表现出明显的有害作用。
表1 喂养90 d内瑞鲍迪甙A对大鼠饲料消耗的影响(n=10)g
表2 喂养90 d内瑞鲍迪甙A对大鼠增重的影响g/(只·d)
表3 大鼠45 d喂养试验后瑞鲍迪甙A对血液细胞学指标的影响(n=10)
注:WBC为白细胞;NEU为中性白细胞;LYMPH为淋巴细胞;MONO为单核细胞;EO为嗜酸性粒细胞;BASO为嗜碱性粒细胞;RBC为红细胞;HGB为血红蛋白;HCT为红细胞压积;PLT为血小板。
表4 大鼠90 d喂养试验后瑞鲍迪甙A对血液细胞学指标的影响(n=10)
注:WBC为白细胞;NEU为中性白细胞;LYMPH为淋巴细胞;MONO为单核细胞;EO为嗜酸性粒细胞;BASO为嗜碱性粒细胞;RBC为红细胞;HGB为血红蛋白;HCT为红细胞压积;PLT为血小板。
表5 喂养45 d时瑞鲍迪甙A对大鼠血液生化指标的影响(n=10)
注:ALT为谷丙转氨酶;AST为谷草转氨酶;TG为甘油三酯;CHO为总胆固醇;Glu为葡萄糖; TP为总蛋白;ALB为白蛋白; BUN为血尿素氮;CRE为肌酐。
表6 喂养90 d时瑞鲍迪甙A对大鼠血液生化指标的影响(n=10)
注:ALT为谷丙转氨酶;AST为谷草转氨酶;TG为甘油三酯;CHO为总胆固醇;Glu为葡萄糖; TP为总蛋白;ALB为白蛋白; BUN为血尿素氮;CRE为肌酐。*与正常对照组比较,P﹤0.05。
表7 喂养45 d时瑞鲍迪甙A对大鼠脏器系数的影响 (n=10)%
注:卵巢和睾丸的数据是5个老鼠的平均值,其他数据均为10个的平均值。
表8 喂养90 d时瑞鲍迪甙A对大鼠脏器系数的影响(n=10)%
注:卵巢和睾丸的数据是5个老鼠的平均值,其他数据均为10个的平均值。
3 结论
该试验研究瑞鲍迪甙A对大小鼠的急性毒性和亚慢性毒性,其中,急性毒性试验采用灌胃给予;亚慢性毒性试验中,瑞鲍迪甙A以20、4和1 g/kg拌料给予大鼠90 d,每周称量大鼠体重和饲料消耗,并在喂养45和90 d时剖检,分别进行血液细胞学和血液生化指标检测,计算主要脏器系数以及进行相应的组织病理学检查。结果表明,瑞鲍迪甙A对大、小鼠的经口LD50分别大于34.0和45.0 g/kg b.w.;亚慢性毒性试验各剂量组大鼠的采食、体重、脏器系数、血液细胞学及血液生化指标、大体解剖及组织病理学检查结果与正常对照组比较无明显差异(P>0.05);瑞鲍迪甙A在1~20 g/kg添加水平,对Wistar大鼠亚慢性毒性试验未表现出明显的有害作用。根据急性毒性试验LD50数据及WHO对化学物质毒性分级标准,瑞鲍迪甙A属于实际无毒级别物质。在目前研究的基础上,瑞鲍迪甙A作为甜味剂饲料添加剂是可行性的。
参考文献
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