鉴定,为穿山甲药材分子鉴定提供科学依据。该实验采用试剂盒法提取穿山甲及其混伪品的基因组DNA,通过PCR扩增和双向测序,应用CodonCode Aligner软件进行校对拼接,采用MEGA 6.0软件对所有7个物种的56份样品进行序列比对,构建邻接(NJ)树。结果表明穿山甲药材COI序列扩增成功,所构建的NJ树结果显示穿山甲及其混伪品均可明显区分。因此,基于COI序列,应用DNA条形码技术可有效鉴定名贵动物药材穿山甲及其混伪品,为其市场监管提供了新的技术手段。
[关键词]穿山甲;DNA条形码;COI;分子鉴定
名贵动物药材穿山甲为鲮鲤科动物穿山甲Manis pentadactyla Linnaeus的鳞甲[1],具有活血消癥、通经下乳、消肿排脓、搜风通络的功效,用于经闭癓瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛、中风瘫痪、麻木拘挛等,是我国传统名贵珍稀中药材。现代药理表明,穿山甲在抗炎镇痛、活血化瘀等方面也有重要作用[2-4]。在我国,穿山甲主要分布于海南、福建、台湾、广东、广西、云南等地,被列为国家Ⅱ级保护野生动物,并被《中国濒危动物红皮书》列为易危级(vulnerable,VU),列入国际濒临绝种动植物贸易公约附录Ⅱ[5]。近年来,由于大量捕捉和栖息地生态环境的变化,穿山甲数量急剧下降,资源短缺现象严重,穿山甲药材价格逐年攀升,药材市场上不断出现猪蹄甲Sus scrofa domestica、黄牛蹄甲Bos taurus、耗牛蹄甲B. grunniens、山羊蹄甲Capra hircus、绵羊蹄甲Ovis aries等混伪品,严重影响了药材质量及用药安全。目前已采用性状鉴别,显微鉴别,RFLP,Cyt b基因片段,RAPD及微卫星DNA分子标记等技术对穿山甲及其混伪品进行了鉴别[6-9]。未见基于COI序列DNA条形码分子鉴定技术对穿山甲及其混伪品鉴别的文献报道。
DNA条形码鉴定技术是近年来国际上生物多样性研究的热点,其核心是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定[10]。2003年,由加拿大分类学家Paul Hebert首次提出将一段长度约为650 bp的COI基因序列作为动物条形码鉴定的基础片段,研究发现该序列的种间变异能较好的区分物种,随后COI基因被公认为动物界中标准的DNA条形码基因[11]。陈士林等[12]提出动物类中药材以COI为主体序列,ITS2为辅助序列鉴定中药材的方法体系。张辉等[13]选取药典中45种动物药利用COI序列进行了分子鉴定的研究。本研究利用COI序列对中药材穿山甲及其混伪品进行鉴定研究,为穿山甲药材的快速准确鉴定提供科学依据,也为临床用药安全奠定基础。
1 材料
本实验所用材料共7个物种56份样品。其中,采集到穿山甲药材样品10份,猪蹄甲4份,黄牛蹄甲4份,牦牛蹄甲1份。所有材料经长春中医药大学张辉教授鉴定,凭证样品保存于中国医学科学院药用植物研究所。实验材料及序列的GenBank登录号分别见表1,2。
2 方法
2.1 药材DNA提取 取药材样品,无菌水浸泡后紫外线进行照射消毒30 min,然后用75%乙醇清洗表面,放置45 ℃烘箱中充分干燥,用已灭菌的手术刀,取甲片残留的腹面皮肤组织约10~25 mg,剪碎后用DNA提取研磨仪(Retsch MM400,Germany)研磨2 min(30次/s)后,使用DNeasy Blood&Tissue Kit提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取总DNA。
2.2 PCR扩增及测序 扩增引物为COI序列通用引物:正向为LCO1490:5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′,反向为HCO2198:5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[14]。PCR反应体积为25 μL,体系内包含ddH2O 9.5 μL,2.5 μmol·L-1 引物各1.0 μL[生工生物工程(上海)股份有限公司合成],2×Taq PCR Mix 12.5 μL,模板DNA 1 μL(约15 ng)。PCR扩增程序为:94 ℃,1 min;94 ℃,1 min,45 ℃,1.5 min,72 ℃,1.5 min,5个循环;94 ℃,1 min,50 ℃,1.5 min,72 ℃,1 min,35个循环;72 ℃,5 min。PCR扩增产物经纯化后使用ABI3730XL (Applied Biosystems Co.,USA)测序仪双向测序。
2.3 数据处理 测序峰图利用CodonCode Aligner V 4.2.7(CodonCode Co.,USA)拼接并校正,去除引物区,获得长度为658 bp的样品序列。对于从GenBank获得的COI序列,采用CodonCode Aligner V 4.2.7软件,与拼接好的样品序列比对后,去除与样品序列相对应的658 bp以外的区段,保留长度≥550 bp的网上序列。最后将序列用软件MEGA 6.0比对并进行遗传距离等分析,并构建NJ(邻接)系统聚类树,同时利用bootstrap(1 000次重复) 检验各分支的支持率。
3 结果
3.1 穿山甲基因组DNA提取及PCR扩增 由于甲片的保存环境具有很大差异,DNA的降解程度不同,提取的穿山甲药材基因组DNA电泳检测显示部分呈弥散状态,说明DNA有一定程度降解。穿山甲所有样本均可以进行PCR扩增,扩增的电泳结果中有4份药材经反复实验后条带仍较弱,阴性对照均无亮带出现,PCR扩增结果见图1。
3.2 穿山甲药材及其混伪品的COI序列鉴定 除穿山甲外,其混伪品每个单倍型选取2~3条序列,通过邻接法(NJ)利用实验序列和GenBank序列所构建的系统聚类树见图2。结果显示,穿山甲不同来源个体均聚为一支,呈现明显的单系性,混伪品猪蹄甲、黄牛蹄甲、耗牛蹄甲、水牛蹄甲、山羊蹄甲、绵羊蹄甲能够与穿山甲准确区分开。因此COI序列作为条形码可快速准确鉴定穿山甲及其混伪品。
4 讨论
4.1 DNA条形码技术在名贵珍稀动物药材鉴定中的应用 名贵珍稀动物药材因其资源少,价格昂贵,历来十分紧缺,药材市场更是混伪品充斥现象普遍,严重影响临床疗效及用药安全。基于COI基因的DNA条形码技术因具有很高的物种鉴定可靠性,在名贵珍稀动物药物种分类和鉴定领域突出了重要作用。张辉等[15-17]利用DNA条形码技术,对名贵药材鳖甲、金钱白花蛇、海龙、海马等药材的COI序列进行比对分析,成功区分开了正品药材与混伪品。张蓉等[18]通过在靠近COI基因5′端设计了1对鹿科动物DNA条形码通用引物,并构建系统进化树,对正品鹿茸马鹿和梅花鹿及其混伪品进行了准确鉴定。
4.2 穿山甲药材DNA提取 甲片组织质地坚韧,DNA较难提取,用传统的酚-氯仿法提取的效果不理想,不能获得可进行后续PCR扩增的有效模板DNA,而且在实验过程中容易出现外源DNA的污染[19-20]。为避免DNA提取过程中可能出现的影响因素,本实验采用试剂盒法,并进行一定的改进,包括样品预处理、严格控制称样量及延长消化时间等方面。甲片组织用无菌水充分浸泡,除去药材表面污染物,清洗后紫外线照射消毒30 min,然后再用75%乙醇溶液清洗表面,放置45 ℃烘箱中充分干燥。取样时要尽可能选取甲片残留的腹面皮肤组织,虽然有一定降解现象,但扩增效果良好。若选取甲片背部,则要刮去表层,且甲片碎片由于高度角质化,DNA提取及扩增效果不如腹面皮肤组织,提取过程较复杂。因此,在今后的鉴定工作及分类学研究中,可注意采集有残留腹面皮肤组织的甲片样品。
穿山甲甲片为表皮高度角质化形成的角质鳞,角化细胞内富含二硫键的角蛋白不易被破坏,导致消化不充分。因此,在实验的过程中,通过对甲片称样量、水浴时间的比较实验,发现称样量控制在10~25 mg、消化时间3 h,都可以提高其消化程度。且需注意的是,在最大程度消化后,快速离心5 min 取上清进行后续试剂盒提取,在抽提及纯化过程中,操作动作应轻柔,避免对样品的DNA造成损伤。
4.3 穿山甲药材DNA条形码鉴定的优势及意义 应用改良后的试剂盒法,能从少量的样品中提取到足够DNA,COI基因序列成功扩增并获得准确有效的条形码序列,在穿山甲物种鉴定方面表现出独特优势。与以往的分子生物学鉴定方法,如RFLP[7],RAPD[6],微卫星标记[8-9]等分子标记技术相比较,DNA条形码技术显示出通用性高、可重复性强的明显优势。鉴定过程更加趋于标准化,操作快速等,在中药鉴定领域中展示了广阔的应用前景。
穿山甲作为我国中医药体系中的传统名贵珍稀药材,市场需求量较大,合法原料供应越来越少,为了获得高额利润,穿山甲走私案时有发生。研究建立的穿山甲药材DNA条形码鉴定技术可以用于穿山甲走私案件的法医鉴定。另外,市售穿山甲药材混伪品种类较多,部分药材商以次充好、以假掺真,只有具备专业水平和丰富鉴别经验的人员才能准确鉴定。本研究建立的DNA条形码鉴定技术不局限于药材外部形态不完整或被破坏的影响,直接从基因水平进行快速准确鉴定,为穿山甲药材鉴定提供了新的方法,也为珍稀名贵动物源中药材市场贸易监测与管理提供可靠技术支持,具有重要的实际应用和参考价值。
[参考文献]
[1]中国药典. 一部[S]. 2010:251.
[2]黄泰康. 常用中药成分与药理手册[M]. 北京:中国医药科技出版社,1994:1460.
[3]高英. 穿山甲与猪蹄甲的成分研究[J].中药材,1989,12(2):34.
[4]张艳. 复方穿山甲口服液的抗炎及镇痛作用[J].安徽医科大学学报,1995,30(2):91.
[5]豆市荣. 中华穿山甲线粒体基因组及分子系统学研究[D].南宁:广西师范大学,2012.
[6]邢亚琳,彭建军,胡慧建,等. 穿山甲标本和甲片的DNA提取及PCR扩增[J].动物学杂志,2013,48(1):49.
[7]Zhang Y P,Shi L M. Genetic diversity in the Chinese pangolin (Manis pentadactyla): inferred from restriction enzyme analysis of mitochondrial DNAs[J]. Biochem Genet,1991,29(9/10):501.
[8]高赛飞,于冬梅,王莹,等. 微卫星标记在穿山甲个体识别中的应用[J] .生物技术通报,2010(12):154.
[9]高赛飞. 蛤蚧微卫星位点的筛选及微卫星标记在穿山甲个体识别中的应用[D]. 广州:暨南大学,2010.
[10]陈士林,郭宝林,张贵君,等.中药鉴定学新技术新方法研究进[J].中国中药杂志,2012,37(8):1043.
[11]Hebert P D N,Ratnasingham S,Dewaard J R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proc R Soc Lond B(Suppl),2003,270:S96.
[12]陈士林,姚辉,韩建萍,等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志,2013,38(2):141.
[13]张辉,姚辉,崔丽娜,等. 基于COI条形码序列的《中国药典》动物药材鉴定研究[J].世界科学技术——中医药现代化,2013,15(3):371.
[14]陈士林.中药DNA条形码分子鉴定[M].北京:人民卫生出版社,2012: 14.
[15]崔丽娜,杜鹤,张辉,等. 基于COI条形码序列的金钱白花蛇及其混伪品的DNA分子鉴定[J]. 世界科学技术——中医药现代化,2011,13(2):424.
[16]胡嵘,杜鹤,崔丽娜,等. 海马、海龙基于COI条形码的DNA分子鉴定[J].吉林中医药,2012,32(3):272.
[17]杜鹤,崔丽娜,张辉,等.鳖甲及其混伪品的DNA分子鉴定[J].世界科学技术——中医药现代化,2011,13(2):429.
[18]张蓉,刘春生,黄璐琦. 鹿茸饮片的DNA条形码鉴别研究[J].中国药学杂志,2011,46(4):263.
[19]史燕,吴孝兵,晏鹏,等. 扬子鳄鞣制皮革和鳞片的DNA提取方法[J].动物学报,2004,50(2):297.
[20]吴唤玲,韩德民,章敬旗,等. 一种从鸟类剥制标本提取DNA的改进方法[J].动物学杂志,2007,42(1):84.
Molecular identification of Manis pentadactyla using DNA barcoding
JIA Jing1,ZHANG Hong-yin1,CHEN Jun2,LIU Dong1,YAO Hui2,QIAN Qi-ni3,ZHANG Hui1*
(1. Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;
2. Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences,
Peking Union Medical College,Beijing 100193,China;
3. Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation,Chongqing 408435,China)
[Abstract] The COI gene as DNA barcode was used to identify the Manis pentadactyla and its adulterants in order to provide a scientific basis for the molecular identification of M. pentadactyla. Genomic DNA was extracted from experimental samples using the DNA extraction kit.The COIgenes were amplified using polymerase chain reaction(PCR) and sequenced bi-directionally. Obtained sequences were assembled using the CodonCode Aligner. The neighbor-joining (NJ) tree was constructed by MEGA 6.0. The results indicated that COI sequences were successfully amplified and NJ trees results indicated that M. pentadactyla and its adulterants can be easily identification.Therefore,the COI gene is an efficient barcode for identification of M. pentadactyla and its adulterants,which will provide a new technique for the market supervision.
[Key words] Manis pentadactyla;DNA barcoding; COI;molecular identification
doi:10.4268/cjcmm20141213